基因工程概论
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第一章基因工程第一节基因工程的概述【学习目标】1、简述基因工程的概念含义,简述基因工程的诞生历程,认同基因工程的诞生和发展离不开理论突破和技术创新2、简述基因工程的原理,说出DNA重组技术的基本工具及其作用、特点,简述基因工程基本操作程序,以及各步骤的一般方法、原理,模拟重组DNA分子的操作过程【课前预习】1、基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,在通过人工和等方法,对生物的基因进行和,然后导入并使重组基因在中表达,产生人类需要的基因产物的技术。
因而又叫DNA重组技术。
基因工程是在水平上操作、改变生物遗传性状的技术,包括基因的、以及在受体细胞内的和过程。
2、为基因工程的创立作出了重要的理论铺垫,而的发现,则直接促进了基因工程的诞生。
1973年,美国科学家将不同来源的两种DNA分子体外重组,并首次实现了在大肠杆菌中的表达。
3、“分子手术刀”:。
其作用的特点是:其产生的DNA末端有两种形式:和。
“分子针线”将双链DNA片段缝合起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的。
4、“运载工具”。
通常利用质粒作为载体。
作为载体必须具备以下条件:载体DNA必需有一个或多个的切割位点;载体DNA必需能在受体细胞中;载体DNA必需带有特殊的基因。
5、基因工程的基本操作步骤包括:①②、③、④6、PCR是一项在生物复制特定DNA片段的核酸合成技术。
目的基因受热形成,与结合,在的作用下延伸形成DNA。
【共同探究】【思考题1】(10全国2)下列叙述符合基因工程概念的是A.B淋巴细胞与肿瘤细胞融合,杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株C.用紫外线照射青霉菌,使其DNA发生改变,通过筛选获得青霉素高产菌株D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上(一)DNA重组技术的基本工具1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能将外来的DNA切断,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息。
复习题一、名词解释1. 原核基因(Prokaryotic gene):由原核生物(如大肠杆菌)基因组编码的基因,以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因,统称原核基因。
2. 真核基因(Eukaryotic gene):真核生物基因组DNA编码的基因,以及感染真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码的基因,统称真核基因。
3. .前导序列(Leader sequence):又叫前导序列区或5'-非翻译区(5'-UTR),,系指位于mRNA5'-起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA 区段。
4. 尾随序列(Tai1er sequence):又称尾随序列区或3'-非翻译区(3'-UTR),系指位于mRNA3'-终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA区段。
5 复制子(Replicon):指有一个复制起始区(oriC)和起始基因的DNA复制单元。
例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等,凡其DNA能够进行复制的遗传单元,均称复制子。
真核细胞基因组的复制子是指含有一个复制起始位点的DNA(RNA)的复制子特称复制单元。
6. 增强子(Enhancer):又叫增强子序列或增强子元件,是真核基因中发现的一种特异序列,能够在距离目标基因50kb以上的位置,从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。
7. 沉默子(Silencer)在真核基因启动子中除了增强子之外,沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。
与增强子一样,沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向,影响相关基因启动子的转录起始效率。
同时沉默子往往是以组织特异性或时间特异的作用方式,控制基因的表达作用。
但与增强子的功能效应相反,沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。
8. 绝缘子(Insulator)亦即是增强子活性的物理边界元件(physical boundaryelement),它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。
一、简述基因研究所取得主要成就,及其与基因工程创立与发展的关系。
1、基因学说的创立孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论,揭示了在染色体上基因的线性排列。
2、DNA是遗传物质从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了DNA的双螺旋模型及半保留复制机理,表明DNA是遗传物质。
3、DNA是基因的载体4、基因是细胞中RNA及蛋白质的“蓝图”。
5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译,基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。
6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展,人们对基因的分子结构有了进一步的认识。
7、随着操纵子模型的提出,人们对基因的表达调控有了进一步的认识。
8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展,基因组文库、cDNA文库、分子探针、PCR 等技术不断被人们运用。
9、目前,不仅能够分离天然基因,还能结合化学合成等方法,在实验室内进行基因的合成、构建,并进行相应的表达分析。
基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科,它的创立和发展,直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步,基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。
二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么?并简述其在基因工程中的应用。
1、三大理论基础:(1)1940年艾弗里(O.Avery)等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA,而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌;(2)1950年沃森(J.D.Watson)和克里克(F.Crick)发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理;(3)1960年关于遗传信息中心法则的确立。
2、三大技术条件:(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现;(2)基因工程载体;(3)大肠杆菌转化体系的建立。
3、应用:通过限制性内切核酸酶和DNA连接酶,可以将切割得到的目的基因与载体连接在一起,经由大肠杆菌转化体系增值复制,为基因工程的后续研究提供基础材料。
基因工程的概述定义:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计,通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术,将外源基因转入大肠杆菌中表达,使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物,构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段,获得有遗传缺陷的动物等。
基因工程又被称为基因拼接技术或者DNA重组技术,可分为微生物基因工程、动物基因工程和植物基因工程三种生物转基因技术。
其主要特点是通过人工转移的方式,将一种生物的基因转移到另外一个受体细胞中,并使该转移基因在受体细胞中表达,从而获得全新的具有生物活性的产物。
基因工程技术为遗传物质研究和医药研究提供了重要的技术支撑。
动物基因工程技术利用先进的生物技术手段对动物基因进行编辑和改造,以达到揭示基因功能和利用基因治疗疾病等目的。
常见的动物基因工程技术包括基因敲除、基因敲入、基因编辑和转基因技术等。
通过使用基因编辑工具精确地切割和删除目标基因的特定区域,使该基因在动物个体中的表达缺失,可以揭示该基因在特定生理过程中的功能和调控机制。
基因治疗能够通过修复或替换患有遗传性疾病的动物个体的缺陷基因来达到治疗和预防遗传疾病的目的。
如利用基因编辑技术可以修复猫头鹰视网膜变性等遗传性视网膜疾病,从而改善视力。
微生物具有结构简单、迅速繁殖的特性,在其繁殖发展中应用生物基因工程技术能取得显著的效果。
将外源基因转入微生物中表达,使微生物能够生产人所需要的产品,如抗体和药用蛋白质等。
利用基因工程技术开发的重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗及基因疫苗,有利于打破传统疫苗的局限性。
植物细胞具有全能性,在特定环境下,植物组织或者细胞能够生长出完整的植株。
所以,可以将药物基因组合到植物细胞内,通过分别培养,得到具有药物基因的植株。
植物独特的稳定遗传特性为医药领域的发展提供了充足而良好的条件。
目前,借助植物基因工程制造的药物有纯化的血清蛋白、干扰素与脑啡肽等。
中国农科院历年考博基因工程概论试题2023年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、简答题1、聚丙烯酰胺、琼脂糖在dna电泳中的区别是什么?2、举出动物转基因的两种方法,并说明其原理。
3、双脱氧法测序的原理。
4、以拟南芥或玉米为例,说明转座子标签法进行基因转移的原理。
5、southern印迹的原理及应用。
三、试论述植物基因工程研究进展以及在农业生产上的意义。
2023年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、名词解释1、限制性内切酶2、同裂酶3、核酶4、2μ环5、hat选择6、ti质粒7、t-dna8、同功trna9、反义trna 10、有义链11、α互补12、基因文库13、cdna 14、染色体步查二.简答题01、举两种植物基因转移的方法?简述其原理。
2、southern印迹的基本原理,这种方法有何应用。
3、噬菌体与cos作载体有何区别?4、aflp的原理及其应用5、普通pcr与rapd有何区别,何谓普通pcr?6、何谓双元载体,简述其组装过程及其作用机理?三、判断题1、无论用哪种转化方法均可用pbr322作载体2、进入细菌的外来dna之所以被降解,是由于细菌只修饰自身dna,不修饰外来dna3、只有粘粒端才可以被连接起来4、用自身作引物合成的cdna链,往往cdna并不完整1998年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、什么是基因工程,基因工程在农业生产上有何意义?二、简答:1、聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳应用有何特点?2、举两种植物基因转移的方法?简述其原理。
3、双脱氧法测序的原理4、转座子标签法克隆植物基因的原理5、southern印迹的基本原理,这种方法有何应用?6、在dna复制过程中会形成一种复制体(replisome)的结构,它是由哪几部分组成的?7、sanger测序法的基本原理是什么?1999年中国农科院博士入学基因工程概论试题一.名词解释:1.cdna 2 ti质粒3. 2u环4. hat选择5 a互补6 yac 7 转导8 基因文库9 限制性内切酶10 染色体步查二.问答题:1 举例说明两种植物转基因的方法。
一、简述基因研究所取得主要成就,及其与基因工程创立与发展的关系。
1、基因学说的创立
孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论,揭示了在染色体上基因的线性排列。
2、DNA是遗传物质
从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了DNA的双螺旋模型及半保留复制机理,表明DNA是遗传物质。
3、DNA是基因的载体
4、基因是细胞中RNA及蛋白质的“蓝图”。
5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译,基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。
6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展,人们对基因的分子结构有了进一步的认识。
7、随着操纵子模型的提出,人们对基因的表达调控有了进一步的认识。
8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展,基因组文库、cDNA文库、分子探针、PCR等技术不断被人们运用。
9、目前,不仅能够分离天然基因,还能结合化学合成等方法,在实验室内进行基因的合成、构建,并进行相应的表达分析。
基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科,它的创立和发展,直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步,基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。
二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么?并简述其在基因工程中的应用。
1、三大理论基础:
(1)1940年艾弗里(O.Avery)等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA,而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌;
(2)1950年沃森(J.D.Watson)和克里克(F.Crick)发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理;
(3)1960年关于遗传信息中心法则的确立。
2、三大技术条件:
(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现;
(2)基因工程载体;
(3)大肠杆菌转化体系的建立。
3、应用:
通过限制性内切核酸酶和DNA连接酶,可以将切割得到的目的基因与载体连接在一起,经由大肠杆菌转化体系增值复制,为基因工程的后续研究提供基础材料。
三、什么是植物基因工程?什么是转基因植物?两者的关系如何?转基因作物对社会和经济发展的意义主要有哪些?
1、植物基因工程:用人工的方法,从不同生物中提取外源基因片段及载体DNA,经过体外切割、拼接和重组,然后采取某种方法,把重组后的带有外源基因的载体DNA引入植物细胞,并使其在植物细胞内进行复制和表达,以达到预期的改变受体植物细胞遗传特性的目的,此种过程即称为植物基因工程。
2、转基因植物:转基因植物是拥有来自其他物种基因的植物。
该基因变化过程可以来自不同物种之间的杂交,但今天该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。
通过植物基因工程中的重组DNA技术可以获得多种类型的转基因植物。
3、利用现代基因工程培育的转基因作物不仅克服了传统育种技术的种种局限性,大大提高了转基因的效率,加快了种质改良进程,而且打破了物种间的遗传壁垒,拓展了新品种研发可选择的特征范围,同时人工设计加工基因的应用则更进一步扩大了可利用的种质资源。
转基因作物是人类按自己的主观意愿有目的、有计划、有根据、有预见地进行遗传修饰过的生物体,是现代生命科学发展的结晶,是人类从认识自然到改造自然的跃迁,标志着人类社会已经步入定向驾驭生物遗传改良的新时代。
转基因作物将在彻底解决资源匮乏、环境恶化、顽症肆虐、粮食短缺等诸多威胁人类生存的难题上成为关键技术和支柱产业。
四、植物基因工程的主要环节有哪些?每个环节的主要任务是什么?
1、从供体生物分离克隆目标基因
(1)目标基因的遗传学研究、分子标记定位,或目标基因编码蛋白的纯化与测序;
(2)构建基因组或cDNA文库;
(3)获得目标基因的探针或引物信息;
(4)标记探针,筛选文库获得目标基因,或直接通过PCR扩增目标基因;
(5)目标基因克隆到质粒载体,转化大肠杆菌,目标基因的测序和分析;
(6)目标基因及其编码蛋白的进一步功能验证和分子鉴定。
2、构建工程载体
(1)采用特定的限制酶切割,从克隆载体上切下并回收目标基因;(2)选取合适的转基因载体,并完成启动子、终止子等元件的亚克隆装载;
(3)采用相同的限制酶切割载体,使其末端与目标基因的末端相匹配;
(4)将目标基因与载体进行连接,形成重组表达载体。
3、转化大肠杆菌和重组载体的分子鉴定
(1)制备大肠杆菌感受态细胞;
(2)将重组载体转化大肠杆菌;
(3)通过抗生素筛选获得大肠杆菌阳性菌落;
(4)通过PCR、限制酶切图谱分析、测序验证等,确认重组载体。
4、植物转化
一般采用农杆菌介导的二元载体转化法,将含有目标基因的T-DNA片段导入受体植物细胞中,并整合到其染色体上;或采用基因枪法,直接将含有目标基因的DNA转化受体植物的器官;或采用病毒接种侵染方式,将目标基因转化受体植物的活体植株。
针对标记基因进行筛选,通过组织培养获得再生植株,或收获活体转化母株上的种子。
5、鉴定和筛选转基因植株
(1)对再生植株进行分子鉴定,如PCR扩增、GUS染色或GFP荧光检测和Southern杂交检测,得到确认外源基因转入并整合的阳性植株;(2)对阳性植株进行RT-PCR、Northern杂交、Western杂交等检测,得到外源基因高水平表达的转基因植株;
(3)对转基因植株进行生物学鉴定与检测,确认背景性状是否改变和目标性状的改良程度,选择和保留最符合要求的转基因植株;
(4)繁殖转基因植株,并跟踪进行分子检测和生物学检测,获得目标性状和背景性状均稳定遗传的株系。
6、转基因植物的安全性评价和产业化
(1)中间试验:向国家申请,在控制系统内或者控制条件下进行小规模试验,并取得合格。
(2)环境释放:向国家申请,在自然条件下采取相应安全措施进行中规模的试验,并取得合格。
(3)生产性试验:向国家申请,在生产和应用前进行较大规模的试验,最终取得安全证书。
(4)大规模推广种植转基因植物。
五、结合植物基因工程的实际应用,谈谈发展植物基因工程的潜力,及植物基因工程发展中应注意的问题。
1、21世纪植物基因工程的发展前景将是非常美好和令人鼓舞的。
从研究进展和发展趋势来看,其热点将突出表现在以下几个方面:
(1)对基因功能的认识
目前,许多国家纷纷投入巨资针对主要的农作物(如水稻)构建其突变体库,然后利用转座子标签(Transposon tagging)、T—DNA标签(T DNA tagging)或图位克隆(map based cloning)技术分离和克隆基园,完成对基因功能的认识,从而全面获得功能性新基因并占有新基因的知识产权。
现在,谁先了解基因的功能,谁就拥有了该基因的知识产权。
因此,世界各国对基因的争夺日趋白热化。
(2)单基因抗性向多基因抗性转化
分子标记辅助选择育种可以实现多种基因的累加,将不同的抗性基因组合到同一品种中,培育出多抗或广谱的种质或品种。
(3)品质性状改良
包括:水果蔬菜的延熟保鲜;有益于健康的植物油(如不饱和脂肪酸);增加营养价值(如维生素);富含抗癌蛋白质的大豆;高营养的饲料(如高赖氨酸、表达植酸酶的玉米);作物加工品质、外观、蒸煮食味品质和营养品质等方面。
(4)由质量性状向数量性状的转移
目前,科学家们正在通过分子标记等技术寻找与重要数量性状(如产量、品质等)相关的数量性状基因座(QTL),最终有可能通过育种程序将这些QTL集中起来加以利用。
作物大多数重要的农艺性状均表现为数量遗传的特点,如产量、熟性和品质等。
数量性状是传统育种的难点,是育种效率的重要制约因素。
近年来,由于分子标记技术的迅速发展特别是完整遗传连锁图谱的建立,人们能够将数量性状分解成易为遗传育种工作者操作的单个位点即QTL进行研究。
(5)转基因技术的改进与提高
目前,在植物基因工程研究中还存在许多技术问题,如受体系统中普通存在的转基因沉默、转化频率低、转化植株后代遗传不稳定、转基因工程作物的生态风险性以及操作简便,费用低廉的转化系统的研制等,这将是今后基因工程研究中的热点问题。
2、植物基因工程发展中应注意以下问题:
(1)安全性问题,即转入的某一特性对最终产品使用的影响,特别是作为食品,对人体有无不良影响。
(2)转基因DNA的移动性,即这种DNA是否会转至其他作物或杂草,因而引起环境及生态问题。
(3)对其他农业措施的后效应,对发展中国家农业及农产品出口的影响等。
(4)公众的接受性,即心理因素。