微生物遗传育种论文格式及讲义要点(ppt最后)

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微生物的遗传变异和育种
（一）转化实验
n 以上实验说明，加热杀死的S型细菌， 在其细胞内可能存在一种转化物质， 它能通过某种方式进入R型细胞，并 使R型细胞获得稳定的遗传性状。
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微生物的遗传变异和育种
（一）转化实验
n 1944年，美Avery等进行了离体条件转化实验。
n 将32P-DNA噬菌体、35S-蛋白质外壳噬菌体 分别感染无放射性的E.coli ，搅拌离心，观 察。发现DNA是噬菌体遗传物质。
n
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微生物的遗传变异和育种
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•用含32PDNA(核心)的噬菌体作感染实验
微生物的遗传变异和育种
•用含35S蛋白质(外壳)的噬菌体作感染实验
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微生物的遗传变异和育种
一、基本概念
n （二）、表型：某一生物体所具有的 一切外表特征及内在特性的总和，是 遗传型在合适环境下的具体体现。
n 表型是一种现实性。
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微生物的遗传变异和育种
一、基本概念
n （三）、变异：在某种外因或内因的作 用下，生物体遗传物质结构或数量的改 变，即遗传型的改变。
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微生物的遗传变异和育种
（三）植物病毒的重建实验：
n 1956，美H.Fraenkel-Conrat，TMV（RNA） 和HRV（与TMV近缘的霍氏车前花叶病毒）。
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微生物的遗传变异和育种
F.Griffith的三组试验：
n 1、动物试验：小白鼠体内加入活R菌或死S菌， 小白鼠活；小白鼠体内加入活S菌，小白鼠死； 小白鼠体内加入活R菌和热死S菌，小白鼠死， 抽心血分离，发现有活的S型细胞－转化现象。

（三）接合的机制
1、接合作用中两菌株性别的存在 Lederberg 和Tatum认为在两个细菌的亲本细胞在接合过程中起同
等作用—即E.coli 的性系统被认为是同宗配合。
1952年，W. Hayes利用Lederberg 和Tatum所做的杂交实验，对 （A）Met－Bio－（Sms或Smr）×（B）Thr－Leu－B1－ （Smr或Sms） 进行研究。结果表明，在杂交期间，两品系所起的作用是不同的，是 一种单向异宗配合过程，两品系在获得的同时发生了性别的变化。其 中，供体品系相当于雄性，而受体品系相当于雌性。
（1）IF以0.3％的频率转变为UF，在经uv处理的IF群体中曾经得到作为 受体高度可育的UF菌株，这种情况类似于从F＋菌株中得到F－菌株； （2）IF×UF杂交中，UF受体菌株全部转变为IF，而染色体基因重组频 率大约为10－4，两者相差万倍。这种情况与F＋ × F－相似。
3、认为NF相当于Hfr的理由
重组是分子水平上的概念，而杂交是细胞水平上的概念。 杂交中必然含有重组，但重组则不限于杂交这一种形式。
第一节 细菌、放线菌的接合及育种
一、细菌的接合作用
接合（Conjugation）：指供体菌与受体菌的完整细胞经过直接 接触而传递大段DNA（包括质粒）遗传信息的现象。
（一）接合现象的发现
1946年，J. Lederberg和E. L. Tatum将来自E.coli K12的两种营养缺 陷型菌株混合培养， 其遗传标记如图。 结果在单独培养的 平板上无菌落，而 在混合培养的平板 上长出了原养型菌 落。
C. 插入区（insertion region）：位于F因子结构图谱的93～17.6kb， 包含四个插入序列，IS3有直接重复的两个，另外两个是IS2和 ， 它们主要与F因子的整合、切除、易位有关γ 。δ

雄性菌株与雌性菌株接合结果
三者根本区别在于DNA转移的方式不同
转化： 供体DNA片断→注入受体细胞，通过细胞膜 接合： 供体进入受体通过性纤毛 转导： 供体DNA片断通过媒介－噬菌体携带进入受体
物理诱变因素 化学诱变因素 生物诱变因素
• 由40年代B、 McClintock对得遗传研究而发现染 色体易位,自1967年以来,已在微生物和其她生物中 得到普遍证实,并已成为分子遗传学研究中得一个热 点。
转化(transformation)
几个概念:转化、转化因子、感受态 转化过程 转化得特点
转 化 (transformation)
受体细胞直接吸收了来自供体细胞得 DNA片断,并把她整合到自己得基因组 中,细胞部分遗传性状发生变化得现 象叫转化。
转化因子
转化就是游离得ＤＮＡ片断得转移和重 组游离得ＤＡＮ片断叫转化因子 转化因子由供体提供 自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生,
• 转座因子
• Transposible Element:
• 在染色体组中或染色体组间能改变自身位置得一 段DNA顺序。也称作跳跃基因(jumping gene)或 可移动基因(movable gene)。
转座因子
• 插入序列 (IS,insertion sequence)
• 转座子 (Tn,transposon,又称转位子,易位子)
ATC ATC ATG CTA CTA CTA CTA CTA 缺少一个碱基
ABC BCA BCA BCA BCA BCA BCA BCA
造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误
染色体畸变
某些理化因子,如Ｘ射线,紫外线, 亚硝酸等,除 能引起点突变外,还会引起DNA分子大损伤,包 括染色体易位,倒位,缺失,重复等,即为染色体畸 变。

吸附
10分钟后 用捣碎器 使空壳脱离
离心
上清液中含 75%放射性
沉淀中含 25%放射性
沉淀细胞进一步培 养后，可产生大量 完整的子代噬菌体
（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中
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（三）植物病毒的重建实验
为 了 证 明 核 酸 是 遗 传 物 质 ， H. FraenkelConrat （ 1956 ） 用 含 RNA 的 烟 草 花 叶 病 毒 （TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。
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DNA是遗传变异的物质基础的证明：
1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的 三个著名实验的论证：
1、肺炎球菌的转化试验； 2、噬菌体感染试验； 3、病毒的拆开与重建试验。
才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。
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一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验
（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith，
代谢
遗传型 + 环境条件
发育
表型
表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在
特性的总和;------是一种现实存在，是具一定遗传型的
生物在一定条件下所表现出的具体性状。
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遗传与变异的概念
变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的 结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几 率出现，（一般为10-6～10-10）；b.形状变化的幅度大； c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。 饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生 在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体 中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c. 因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失 后，表型即可恢复。

凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出 来的突变株。
非选择性突变株（non-selective mutant）
反之。
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营养缺陷型（株）
选择性突变株
抗性突变型（株） 条件致死突变型（株）
突变株的表型
形态突变型（株）
非选择性突变株
抗原突变型（株）
橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。
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表型的差异只与环境有关
暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的 行为
例如：粘质沙雷氏菌：
25℃下培养，产生深红 色的灵杆菌素；37℃下 培养，不产生色素； 重新将温度降25℃，又 恢复产色素的能力。
表 型 饰 变：
斜面培养 液体培养
（一）经典转化试验
最早进行 转化（transformation）实验的是F. Griffith（ 1928年），他以Streptococcus pneumoniae （肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”）作为研究对象。
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转化实验
实验材料： 肺炎双球菌
光滑型（S）
核外DNA的种类
真核生物的 “质粒”
线粒体 细胞质基因 叶绿体
中心体 动体 共生生物：卡巴颗粒
酵母菌的2m质粒
核外染色体
原核生物的
质粒
F因子
R因子
Col质粒
Ti质粒
巨大质粒 降解性质粒
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（一）核酸存在的 7 个水平
细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核 细胞核水平: 原核与真核生物的细胞核结构不同，核外 DNA 染色体水平: 倍性 ( 真核 ) 和染色体数 核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体

3. 杂交：分别取200 μl根瘤菌和E.coli菌悬液混合，加
1000 μl TY培养基，静置24 h后涂布选择性平板筛选 杂交子。 4. 选择性平板：无氮培养基（Kn 50 μg/ml，Rif 50 μg/ml） 5. 挑取杂交子在双抗无氮培养基上划线纯化。
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四、电转化
实验步骤 准备工作：①制备选择性平板TY培养基（Kn 100 μg/ml，Rif 100
清洗电转化样品槽。先用自来水吸瓶冲洗十多次，之后加 入酒精，放置1 h，之后用蒸馏水冲洗数次，甩干后，水平 放置在滤纸上晾干。
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五、杂交子鉴定
实验步骤： 挑取在选择性平板上生长的菌落，划线纯
化，观察菌落特征和多糖产量。 挑取纯化后的杂交子接种于蔗糖培养基，
振荡培养36 h后观察并测定多糖产量。
蔗糖酵母膏培养基（培养根瘤菌）：蔗糖10.0 g，酵母膏 4.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，钼 酸钠（0.5%溶液）4.0 ml，硼酸（0.5%溶液）4.0 ml，碳 酸钙5.0 g，水1000.0 ml，pH 7.2-7.4。多糖测定用， 250ml/500ml三角瓶，每组4瓶。
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培养基
TY培养基（培养根瘤菌）：胰蛋白胨5.0 g， 酵母粉3.0 g，CaCl2 0.3 g，水1000 ml， pH7.0
蔗糖酵母膏培养基（培养根瘤菌）：蔗糖 10.0 g，酵母膏4.0 g，磷酸氢二钾0.5 g， 硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，钼酸钠（0.5% 溶液）4.0 ml，硼酸（0.5%溶液）4.0 ml ，碳酸钙5.0 g，水1000.0 ml，pH7.2-7.4
μg/ml）。②提取要转化的质粒DNA，miniTn5。③制备根瘤菌菌悬 液。 转化：在电转化用的石英样品杯、质粒DNA、TY培养基、根瘤菌菌 悬液50 μl按顺序对应置于冰上预冷。将冰桶移置超净工作台上，取 200-1000 µl、20-100 µl、0.5-10 µl 移液器到超净工作台上。先用0.510 µl移液器取2 µl质粒DNA到根瘤菌细胞内，再用调节到50 µl 的（ 20-100 µl移液器）上下吹吸数次。在冰上放置2 min。用调节到50 µl 的（20-100 µl移液器）将质粒DNA和细胞混合液转移到电转化石英 样品槽底凹槽的中央，在桌面上轻击数次使之分散。在冰上放置1-2 min。先用纸将样品槽擦拭一下，移到2 kV电脉冲发生器上，同时用 1000 µl移液器吸好TY培养基1 ml，约4.5-5 sec后鸣叫声停后，立即加 入样品槽内（吹吸一次或不吹吸）。

• 通过基因工程力法改造传统发酵工艺——如氧传递有关的 血红蛋白基因克隆到远青链霉菌，降低了对氧的敏感性， 在通气不足时，其目的产物放线红菌素产量可提高4倍； 同样对头抱留素C产生菌也获得工程菌，取得了相同的效 果；
• 通过基因工程方法提高菌种抗性——构建包括活性干酵母 和酵母工程菌，抗噬菌体谷氨酸工程菌以及利用工程菌处 理工业废料和废水等。
微生物细胞机器的工作模式
菌种选育和工艺控制的“五字策略”
N
P
P
Working pattern of cell-machine in Industrial Fermentation
进 通 节 堵出
• 生产菌种应该具备的基本特性： – 生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵 产物的能力。
– 在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近 的副产物及其他产物。
菌种筛选
菌种选育
空气 空气净化处理
保藏菌种 斜面活化
碳源、氮源、无机盐等 营养物质
扩大培养
微 生
物
种子罐
制 剂
主发酵
灭菌
生 产 的
一
般
产物分离纯化工艺来自流成品程
• 因此，工业微生物育种对于提高发酵工业产品的产量 和质量，进一步开发利用微生物资源，增加发酵工业 产品的品种，具有重大意义。
2 菌种是发酵工业的关键和灵魂
Kary B. Mullis (1944 -)
通过场因工程的方法生产的药物——已获得包括治疗用 药物、疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等几十种批准上市的 品种。
通过基因工程方法提高菌株生产能力——已获得包括氨苯 酸类(苏氦酸、精氨酸、虽氨酸、脯氨酸、组氨酸、色氨 酸、苯丙氨酸、赖氦酸、绩氨酸等)、工业用酶制剂(脂肪 酶、纤维累酶、乙酰乳酸脱按酶从淀粉酶等)以及头抱菌 素C的工程菌，都大幅度提高了生产能力；