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RNA干扰_RNAi_的研究进展

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第30卷　第4期青　海　医　学　院　学　报Vol.30　No.4 2009年J O URNAL O F Q I NGHA IM E D I CAL COLL EGE2009RNA干扰(RNA i)的研究进展马元春　张得钧(1.青海卫生职业技术学院;2.青海大学医学院临床医学系)中图分类号　R318 文献标识码　A　 RNA干扰(RNA interference,RNA i)是指在多种生物细胞中,外源或内源性双链RNA(ds RNA)可以高效促使胞内同源mRNA降解,进而阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。

作为一种全新的基因治疗的方法,本文将对RNA i的作用机制、研究策略以及应用研究进展等内容进行综述。

1　RNA i作用机制 si RNA、m i RNA和p i RNA均可通过相应机制进行RNA i,它们之间既有联系又有区别。

1.1　si RNA(short interferingRNA)的作用机制 现已阐明以ds RNA介导的靶mRNA降解的机制包括两个阶段。

第一阶段是起始阶段:外源或内源性的ds RNA被核酸酶Rnase III家族中的D icer酶特异识别,并将其逐步切割成长约21～23nt的双链RNA 片段(si RNA)。

第二阶段是效应阶段:si RNA的引导链与解旋酶、ATP及多个蛋白形成诱导沉默复合体(R I SC),而si RNA的另一条链即过客链则被清除。

随后与R I SC结合的引导链识别靶mRNA,并通过碱基配对结合到靶mRNA上,在距离si RNA3′端一定的位置上切割靶mRNA,从而沉默对应的靶基因。

在切割靶mRNA时,会产生更多21～23nt的si RNA,这些si RNA又会形成更多的R I S C,继续对靶mRNA进行切割,经过多次合成———切割循环,沉3默信号就会不断放大,最终清除所有的靶mRNA,进而阻断或降低相应靶基因的表达,产生RNA i现象,这种RNA i机制属于转录后抑制(PTGS)。

另外在转基因真核生物中的ds RNA还可引起靶基因的甲基化、染色质重构及异染色质化,从而促使异常RNA产生,最终沉默靶基因。

1.2　m i RNA(m icr oRNA)的作用机制 2001年三个实验室同时发现了微小RNA(m i R2 NA),m i RNA大约由2l～23nt非编码单链RNA分子组成,可引发RNA i现象。

目前的m i RNA数据库已经收录了8000多个m i RNA,其中有人类的m i RNA近700个。

si RNA与m i RNA在形成过程和作用机制上存在较大差异。

在m i RNA生成过程中,首先编码m i RNA的基因转录出初级产物(p ri m i RNA),接着由属于RnaseⅢ家族的D r osha将p ri-m i RNA剪切成长度约为80bp s的发卡状结构的m i RNA前体(p re-m i RNA)。

p re-m i RNA在Ran-GTP和转运蛋白Ex2 portin-5的协同作用下转运出核进入胞质,经D icer 酶切割成约22nt的成熟m i RNA。

成熟m i RNA要么与si RNA一样,与靶mRNA结合促进其降解,这与si RNA一样属于转录后抑制;也可以结合到靶mRNA 的3’U T R部位抑制其翻译,这属于mRNA的翻译抑制。

1.3　p i RNA(p i w i-interacting RNA)的作用机制 2006年先后有五个独立的实验室在哺乳动物雄性大鼠睾丸内分离出一类特异表达的内源性非编码小RNA,长度介于26～31nt之间,在精子的发生过程中起着重要的调节作用。

由于它的5′端具有尿嘧啶偏向性(约86%),只能和A rg onuat蛋白家族中的Pi2 wi亚家族蛋白结合后才能发挥调控作用,故命名为Pi w i相互作用RNA(Pi w i2interactingRNA,p i RNA)。

研究表明,p i RNA在分子大小、分子结构、来源、作用机制等方面均区别于前两种小RNA。

首先,p i RNA 来自长单链RNA前体,或两股非重叠的双向转录前体,而m i RNA与si RNA分别由短发卡RNA前体和双链RNA前体生成;其次,目前只在哺乳动物和模式生物的生殖腺细胞及部分干细胞发现它的表达,而si R29723马元春(1975～),女,汉族,青海籍,讲师NA与m i RNA在动植物的各组织中均有表达;第三,现已明确p i RNA的生成与D icer无关,而是由长的单链RNA前体p re2p i RNA加工而来;另外p i RNA和m i RNA均为单链小RNA,si RNA则为双链小RNA。

p i RNA具有维持生殖系DNA完整、抑制转座子转录、抑制翻译、调节精子的生成及小RNA基因沉默等方面的生物学功能。

2　RNA i技术的研究策略 RNA i技术即利用体外合成的短双链RNA(ds R2 NA)抑制胞内特定基因表达的技术。

其研究策略主要包括五个步骤:①确定靶基因:一般是与疾病发生发展密切相关的基因。

②设计si RNA序列:目前根据mRNA的靶标序列和RNA二级结构为基础可设计出最优化的si RNA序列。

③获得si RNA产物:通过PCR扩增si RNA表达框架、体外转录,或利用D icer 酶或Rnase III降解长片段的ds RNA等方法获得。

④si RNA转染靶细胞;需要某种介质携带进入细胞,这是决定RNA i沉默效果的关键步骤。

⑤利用细胞生物学和分子生物学方法检测RNA i效果。

3　RNA i技术的特征3.1　序列上的高度特异性:si RNA与靶基因的mR2 NA在序列上严格遵循碱基配对原则,这样就能特异性地干扰靶基因表达,而和靶基因同属一个基因家族的其他基因则不会受到影响。

3.2　抑制基因表达的高效性[1]:RNA i对基因表达的抑制率可达90%以上,而且仅需极少量的ds RNA就能产生强烈的RNA i,这种极高的抑制效率是传统实验技术所无法媲美的。

3.3　化学性质的高度稳定性[2]:由于si RNA是在3′端带有2个TT碱基的ds RNA,所以化学性质非常稳定,不需要通过广泛的化学修饰来提高半衰期。

3.4　RNA i抑制作用的迅速性:RNA i能快速降解胞质中的靶mRNA,从而使靶基因无法产生蛋白质产物,达到沉默靶基因的目的。

3.5　RNA i效应的依赖性[3]:沉默效应只有连续输入ds RNA才能持续下去,而且ds RNA的初始浓度影响RNA i效应的强度。

3.6　RNA i效应的可遗传性和高穿透性:ds RNA可通过质膜、细胞间隙和细胞屏障而转运,并能在不同细胞或生物间长距离传递和维持,甚至可传给子代(线虫)。

4　RNA i技术在疾病治疗上的应用研究 医学界一直很关注以RNA i为基础的病毒性疾病、遗传病和肿瘤等疾病的治疗研究。

目前研究主要处于临床前实验阶段,但已有少数已进入人类临床试验阶段。

研究表明,RNA i结合转基因策略,将组织特异性的RNA i有效地导入患者体内,通过沉默某些致病基因来实现相关疾病的治疗。

4.1　在肿瘤治疗方面的应用研究 癌症被认为是一种遗传性疾病[4]。

近年来迅速发展起来的RNA i技术彻底改变了治疗这种破坏性疾病的思路[5]。

在抗肿瘤治疗中,RNA i可用于抑制癌基因的表达;也可用于抑制肿瘤发生发展相关基因(如血管内皮生长因子VEG C)的表达;或者抑制融合癌基因(在白血病尤为普遍)的表达;还可以抑制放化疗过程中肿瘤抗性产生的相关基因(如肿瘤的多药耐药基因MDR)的表达。

这些是利用RNA i进行抗癌治疗时四个主要的作用靶点。

第一个应用RNA i进行抗癌基因治疗探索的靶基因是癌基因[6]。

中国科学院生物物理研究所通过人工模拟合成针对hd m2基因(引起乳腺癌的重要基因)的ds RNA(hd m22si RNA),并将其导入已患人乳腺癌的裸鼠体内,发现可以明显抑制hd m2的表达,并使其沉默,同时还抑制了Bcl22、NF2k B以及Ras等癌基因的表达,激活了细胞内P53、P21、BRCA1和Bax等抑癌基因的表达,使机体内抑癌基因的蛋白表达显著增强,引起肿瘤细胞的凋亡,继而发生一系列与肿瘤生长相关的信号传导反应,最终抑制乳腺癌的生长。

此外,他们还观察到hd m22si RNA具有活体内的抗肿瘤特性,促使一种叫丝裂霉素的乳腺癌临床治疗药物更有效地杀死乳腺癌细胞[7]。

肿瘤在发生发展中具有血管依赖性,血管内皮生长因子(VEGF)编码的糖蛋白可促进新生血管的形成并增加血管的通透性,研究者利用RNA i封闭了VEGF基因,进而阻遏癌发部位的血管生成从而抑制肿瘤生长。

还有肿瘤的多药耐药性基因(MDR)是导致肿瘤化疗失败的主要原因,RNA i已用于沉默多个MDR相关基因的表达,增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

如在MDR中,NF-кB p65有调节细胞生长、凋亡等作用,Guo等[8]应用RNA i技术抑制了NF -кB p65亚基的表达,从而加强了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

另外,融合基因也是RNA i抗癌治疗的靶点之一,如人类9号染色体上的C-ABL基因与22号染色体上的BCR基因发生易位后形成融合基因BCR/ABL,该融合基因在慢性粒细胞白血病发病中起重要作用,研究人员利用RNA i成功抑制了K562082白血病细胞中BCR/ABL融合基因的mRNA的的转录[9]。

尽管在哺乳动物细胞中RNA i不能完全阻断致病基因的表达,但RNA i技术的特异性、高效性特点使其在肿瘤基因治疗方面显示出了优越性。

4.2　在抗病毒感染方面的应用研究 在抗病毒研究领域,目前主要把RNA i放在病毒性肝炎、流感、脊髓灰质炎、人类免疫缺陷病、S ARS等疾病中进行研究。

研究探索的主要思路是设计靶向病毒关键基因的小干扰片段来抑制病毒在胞内的复制和表达。

首个运用RNA i技术进行试验的感染因子是人类免疫缺陷病毒(H I V-1),该病毒基因组和与其生命周期相关的宿主因子上许多位点都可作为si RNA 的靶点。

Jacque等[10]设计针对H I V21基因数个区域的si RNA,这些区域包括长末端重复序列(LT R)及辅助基因vif和nef,发现其能有效抑制H I V21病毒周期的晚期活动,并能使感染细胞的病毒产生量减少96. 67%～98.00%。

CCR5是H I V21感染细胞的必需辅助受体,有研究者[11]将si RNA转染Magi2CCR5细胞, 4天后检测到细胞表面CCR5表达量减少90%以上,表明以该受体为靶点能有效抑制H I V21感染。

此外还有很多研究也表明RNA i将成为攻克艾滋病的有力武器。

在抗乙型肝炎病毒(HBV)的研究中,一般选择HBV基因组保守基因区域作为si RNA序列的靶位点。

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RNA干扰技术的研究进展

RNA干扰技术的研究进展


结合导致靶基因的降解，进而导致目的产物表达 的下调¨。。。外源ｄｓＲＮＡ进入细胞后产生的小分 子干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ
ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）的反义
链和多种核酸酶形成了沉默复合物（ＲＮＡ．ｉｎｄｕｃｅｄ
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ
ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ），ＲＩＳＣ通过结合和切割
ｍＲＮＡ的作用而介导ＲＮＡ干扰的过程…。就其作 用机制、特点及在疾病中治疗作用进展方面作一 综述。
１．３
或启动子序列构成的外源ｄｓＲＮＡ无法引起ＲＮＡｉ效 应；ｄｓＲＮＡ的长度对ＲＮＡｉ的效率有影响。
２．３
高效性
只需少量ｄｓＲＮＡ的引入便可抑制浓度是几倍 甚至几十倍的ｍＲＮＡ的降解¨引。可能的原因：① ＲＮＡｉ存在级联放大效应¨１。相比普通的ｓｉＲＮＡ。 ｓｈＲＮＡ产生的ＲＮＡｉ效应更强；②可能与ＲｄＲＰ的 作用有关，即在ＲｄＲＰ的作用下，ｄｓＲＮＡ得以复制， 从而产生更多的ｄｓＲＮＡ导致ｍＲＮＡ降解Ｈ５１。
２．４
可传播性和可遗传性 ＲＮＡｉ抑制基因表达的效应可以越过细胞界限。
在不同的细胞间长距离传递和维持。值得注意的 是，大于３０ ｎｔ的ｄｓＲＮＡ在哺乳动物细胞中可产生 非特异的基因抑制效应，其可诱发细胞内的干扰素 系统，激活ＲＮＡ依赖蛋白激酶ＰＫＲ，使翻译起始因 子２的ａ亚基（ＥＩＦ２ａ）被磷酸化，导致翻译过程被阻 断，同时激活ＲＮＡ酶配体（ＲＮａｓｅＬ），诱导干扰素的 产生，从而抑制蛋白质的合成，导致细胞凋亡¨６｜。 然而，在胚胎干细胞或畸胎癌细胞系中不存在这种 干扰素效应。长的ｄｓＲＮＡ仍可引起基因特异性的
收稿日期：２０１０－０２－０４ 作者简介：何菲，男，本科，住院医师，研究方向：心血管内科；Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｑｌｅｊ００１＠１６３．ｃｏｒｎ 通讯作者：邹凡文，女，本科，副主任医师，研究方向：心血管内科；Ｅ—ｍａｌｌ：ｄｗｌ６６３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ
RNA干扰技术的研究及进展

RNA干扰技术的研究及进展

RNA干扰技术的研究及进展RNA干扰是近几年兴起的一种新技术，它是由双链核糖核酸引起的抑制基因表达的一种现象。

这种新技术在抗病毒、抗癌症和基因病等医学领域表现出了广阔的应用前景。

本文就RNA干扰的作用机制、研究进展进行综述。

标签：RNA干扰技术基因沉默研究进展RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现的一种高效特异地阻断基因表达的新技术。

RNAi 是指一些小的双链RNA（dsRNA）在细胞内Dicer 内切酶的识别、结合、酶切下，产生有活性的长度为21～23nt 干扰性RNA（short interfering RNA ，siRNA），与互补的目的基因的mRNA 结合并使之降解，从而到达抑制目的基因表达的作用，是一种由双链RNA诱发的“基因沉默”现象。

本文旨在讲述RNA干扰的作用机制及研究进展。

1. RNA干扰技术的作用机制RNAi是指细胞中导入与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA （double—stranded RNA，dsRNA）片段，可致该mRNA发生特异性降解从而导致基因表达沉默的现象[1]。

其作用机制是：外源性（如病毒）或内源性的dsRNA 在细胞内与一种具有dsRNA特异性的RNA酶Ⅲ内切核酸酶（RNaseUIendnuclease）——Dicer结合为酶dsRNA复合物，随即被切割成21～23nt的RNA片段，即siRNA。

siRNA与Dicer形成RISC。

siRNA 作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体结合mRNA.随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段，从而可以破坏特定目的基因转录产生的mRNA，使其功能沉默，即基因沉默（gene silencing）。

而新产生的siRNA片段可再次与Dicer酶形成RISC复合体，介导新一轮的同源mRNA降解，从而产生级联放大效应，显著增强了抑制基因表达的作用2. RNA干扰技术的临床应用与进展2.1抗肿瘤治疗2.1.1白血病的治疗化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要地位。

RNA干扰与siRNA研究进展

RNA干扰与siRNA研究进展

RNA干扰与siRNA研究进展一、本文概述RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种广泛存在于生物体内的基因沉默现象，其通过双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱导同源mRNA的降解，从而实现对特定基因表达的调控。

自1998年Fire和Mello首次在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现这一现象以来，RNAi已成为生物学领域研究的热点之一。

siRNA （small interfering RNA）是RNAi过程中的关键分子，其通过与mRNA的特异性结合，引导RNA诱导的沉默复合物（RISC）对mRNA进行切割，从而实现基因沉默。

近年来，随着研究的深入，人们对RNAi 和siRNA的作用机制、生物学功能以及应用前景有了更深入的了解。

本文旨在综述RNA干扰与siRNA研究的最新进展，探讨其在基因功能研究、疾病治疗以及农业生物技术等领域的应用前景。

二、RNA干扰机制RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种在生物体内广泛存在的基因表达调控机制，主要通过双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发，导致同源mRNA的降解或翻译抑制，从而实现基因沉默。

RNAi机制的核心是siRNA（small interfering RNA）的生成和作用。

siRNA的生成起始于dsRNA的形成。

这些dsRNA可以是由外源基因导入的，也可以是细胞内自身产生的。

当dsRNA进入细胞后，会被一种名为Dicer的核酸酶识别并切割成21-23个核苷酸长度的siRNA。

Dicer酶在切割过程中，会在siRNA的3'端添加2个核苷酸（通常是尿嘧啶），形成siRNA的双链结构。

随后，siRNA会与一种名为RISC（RNA-induced silencing complex）的蛋白复合物结合，形成RISC-siRNA复合物。

RNA干扰在医学的应用前景

RNA干扰在医学的应用前景

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Shanghai Med J , 2005 ,Vol 28 ,No 3
·综述 ·
RNA 干扰在医学的应用前景
孙剑
RNA 干扰 ( RNA interference , RNAi) 是一种 在双链 RNA (dsRNA) 诱导下 ,序列特异的基因表 达沉默 ( silencing) 机制[1] 。作为一种自然存在的 抗病毒感染方式 , RNAi 被植物 、动物等真核细胞 生物用来抵抗病毒感染 。因为 RNAi 的特异性和 高效率 ,目前国外正利用 RNAi 分析基因组功能 , 并探讨其治疗肿瘤和抗病毒感染 ,取得了良好的试 验结果 。现就 RNAi 在医学中应用的研究进展和 前景作一综述 。
上海医学 2005 年第 28 卷第 3 期
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( E GFR) 的过度表达是乳腺癌等肿瘤的特征和致 癌基因 ,BCR/ ABL 是导致慢性粒细胞性白血病 (CML) 和 30 %成人急性淋巴母细胞白血病 (ALL) 的癌基因 。因此 , RNAi 抑制癌基因的表达 ,可以 阻止癌细胞的生长 ,达到治疗肿瘤的目的 。在表皮 样癌细胞系 A431 中 , siRNA 诱导的 RNAi 能使 E GFR 下降 90 %[10] 。在以表达 BCR/ ABL 的细胞 系 K562 为 细 胞 模 型 的 研 究 中 发 现 , 针 对 BCR/ ABL 的 siRNA 特异地减低 BCR/ ABL 基因的表 达 ,并引起 57 % 的 K562 细胞凋亡 。2 个碱基的改 变使 siRNA 失去了诱导 RNAi 效应 ,表明其作用 具有高度特异性[11] 。但使用的 si RNA 是人工合 成的 ,诱导的 RNAi 作用也是暂时的 。还需要研发 长久的 RNAi ,以实现治疗的目的 。