2019-2020学年人教版生物选修一讲义：专题2 课题1 微生物的实验室培养

课题1 微生物的实验室培养学习目标：1.知道培养基的种类、营养要素及配制原则。

(重点) 2.掌握消毒、灭菌的原理和方法。

(重点) 3.学会配制培养基和纯化大肠杆菌的方法。

(重、难点)1．培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

(2)种类：按物理性质分⎩⎪⎨⎪⎧液体培养基：配制成的液体状态的基质（加入凝固剂，如琼脂）固体培养基：配制成的固体状态的基质(3)营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH 、特殊营养物质(如维生素、氨基酸和碱基等)以及氧气的要求。

2．无菌技术(1)无菌技术的目的是防止外来杂菌的入侵。

主要内容包括： ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

(2)消毒和灭菌：(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基①⎩⎨⎧最常用的细菌培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基配制步骤：计算―→称量―→溶化―→灭菌―→倒平板②培养基应采用高压蒸汽灭菌；倒平板时要待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行，等平板冷凝后将平板倒置。

(2)纯化大肠杆菌①纯化培养的原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即获得较纯的菌种。

②纯化培养方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上纯化大肠杆菌，最常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。

ⅰ平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

ⅱ释释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

③培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱中，培养12 h 和24 h 后，分别记录观察。

④菌种保存：1．判断对错(1)高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖。

( )(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。

( ) (3)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。

( ) 提示：(1)× 在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的压力降到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。

(2)× 倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。

(3)×接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落。

2．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是( ) A ．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B ．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C ．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D ．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板C [制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。

]1．虽然各种培养基的具体配方不同，但是一般都含有哪些成分？提示：虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子。

另外，还必须满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。

2．对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。

3．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。

[归纳总结]1．培养基的配制原则(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。

(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。

(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾－磷酸二氢钾。

2．培养基的成分及功能下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是()D[在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。

高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。

](1)表格中的蛋白胨主要为微生物提供何种营养成分？(2)乳糖和蔗糖在培养基中的作用是什么？(3)如果用培养基培养某种自养微生物，则该配方中的哪种物质可以去除？提示：(1)主要为微生物提供碳源、氮源和维生素。

(2)可以为微生物提供碳源和能源。

(3)乳糖和蔗糖。

1．关于灭菌和消毒的不正确的理解是()A．灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质上是相同的C．接种环用灼烧的方法灭菌D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌等B[消毒是指用温和的理化方法杀死体表或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，灭菌则是用强烈的理化因素杀死体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

] 2．空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。

某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。

实验步骤如下：①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；②制作无菌平板；③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________________。

若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

(2)步骤③中，实验组的操作是___________________________。

(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。

[解析](1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。

若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。

(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。

(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。

[答案](1)牛肉膏、蛋白胨琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(3)污染1．接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？提示：(1)划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。

(2)划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。

2．在倒平板时为何要在酒精灯的火焰旁进行？提示：酒精灯的火焰旁是无菌区域，在酒精灯的火焰旁操作，可以避免周围环境中微生物的污染。

3．接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。

如果有菌落生长，说明了什么？提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。

若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。

[归纳总结]1．平板划线法(1)操作步骤(2)注意事项①第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。

②灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。

③在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

④划线时最后一区域不要与第一区域相连。

⑤划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。

2．稀释涂布平板法(1)操作步骤①系列稀释操作：a．将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。

b．用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。

用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。

c．从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复b步的混匀操作。

依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。

②涂布平板操作：(2)注意事项①每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2 cm处。

②涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。

③不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。

④酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体。

3．实验结果分析与评价(1)未接种的培养基表面若有菌落生长，说明培养基被污染；若无，则说明未被污染。

(2)在接种大肠杆菌的培养基上可观察到独立的菌落。

有光滑型菌落，菌落边缘整齐，表面有光泽，湿润、光滑、呈灰色；也有粗糙型菌落，菌落扁平，干涩、边缘不整齐；还有黏液型菌落，为含荚膜菌的菌落。

(3)培养12 h和24 h，菌落大小不同，培养24 h，菌落大，灰色深，光泽度强。

(4)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯、混入其他杂菌或在实验操作过程中被杂菌污染。

下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法操作结果。

下列叙述中，错误的是()A．甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液B．对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成C．乙中培养皿中所得的菌落都符合要求D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端[技巧点拨](1)对菌液进行稀释时，菌液中的菌体的浓度越高，则稀释的倍数也要越高，菌体的浓度低时，则稀释的倍数不必太高。

(2)高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要冷却后才能接触菌种。

(3)平板划线法的多次划线中，菌体越来越少，即不同划线处的菌体数目不同，所以形成的菌落并非全部是由单个菌体繁殖而成的。

C[灼烧后的接种环如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确；稀释倍数过低，会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确；平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。

](1)两种接种方法中，如果操作均正确无误，只有稀释涂布平板法才适合对细菌进行计数而平板划线法不能，请简述原因。

(2)稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键，决定稀释倍数和划线次数的因素是什么？提示：(1)只要稀释倍数足够高，则稀释涂布平板法中形成的每个菌落都是由单一菌体繁殖而成的，即一个肉眼看不见的细菌对应着一个可以看见的菌落，可以通过统计菌落的数目推测出细菌的数目。