微生物细胞大小与数量的测定一、实验目的1.了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。
2.学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。
3.了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算。
二、实验原理1.微生物大小测定原理微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。
由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。
用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
（1）目镜测微尺目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
图 1 目镜测微尺（2）镜台测微尺镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
图2 镜台测微尺2.显微镜计数法测定微生物的原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。
后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02立方毫米，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。
显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。
但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。
目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。
本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。
另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。
用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。
该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。
每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为l平方毫米，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.l立方毫米(万分之一毫升)。
计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lmL菌液中的总菌数。
设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/5×25×10000×B=50000A•B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×10000×B=32000A•B（个）a.平面图(中间平台分为两半，各半边有一个方格网)b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)图3 血球计数板计数网的分区和分格图4 血球计数扳的构造三、实验材料1.仪器显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸，酒精灯2.材料酵母菌液3．试剂蒸馏水等四、实验步骤流程：（1）置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测菌体大小→记录结果→用毕擦拭干净（2）稀释样品→检查计数板→加样→计数→计算→清洗1．目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。
先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。
因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
（注意：由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度；观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度：换高倍镜和油镜校正时，务必十分小心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。
）2．菌体大小的测定(1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液。
(2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
(3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的直径占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。
测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的直径。
（注意：一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。
而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。
）3. 细菌数量的测定(1)菌悬液制备以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液，取六只试管10-1为梯度进行稀释，形成六个浓度的菌悬液并标号。
(2)镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。
若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。
(3) 加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液（10-2）由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
（注意：取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。
）（4）显微镜计数加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。
一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。
每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。
位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。
如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。
计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。
（5）清洗血细胞计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。
镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。
若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
五、实验结果酵母大小（直径）值＝4.39μm——10.25μm六、思考题1、什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情况下重复使用，故当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。
2、在不改变目镜和物镜测微尺，而改变不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？答：理论上是相同的。
因为测量出来的值是它的实际大小，是不变的，而物境倍数的改变的同时，测微尺的目测间隔也改变，但读数不变。
但是不同倍数下校正结果可能会有误差，因此结果也会有误差。
3结合你的实验体会，总结哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如何避免？答：（1）造成误差的因素：技术误差（器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等）；固有误差（计数板、盖片、吸管等仪器不够准确与精密，细胞分布不均匀等）。
（2）应如何避免：①所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。
②细胞稀释液应新鲜、无杂质微粒。
③严格操作，稀释与计数时的取样要在充分混匀后进行。
④尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。
（4）某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-2种可行的检测方法。
答：方法一：用待测样品与标准样品进行对比发酵试验。
可以根据发酵成熟时间或者发酵产物的生成量，或者产物生成速度对比，来求得样品中的活菌的成活率。
方法二：将该酵母粉进行梯度稀释与美兰染色，取样在血球计数板下进行活菌与死菌的计数，求算存活率。
