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安捷伦 分析方法验证

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cGMP

GCPISO 17025PIC/S GxP

FDALOD/LOQ

OECDQA/QC

API EPSOPUSP <1225/1226>

ICH Q2(R1)

分析方法验证基础导论1引言任何分析测试的目的都是为了获得稳定、可靠和准确的数据。分析方

法验证在其中起着极为重要的作用。方法验证的结果可以用于判断分

析结果的质量、可靠性和一致性，这是所有分析质量管理体系不可分

割的一部分。许多法规和质量管理标准也要求实验室进行分析方法

验证。

在下列情况下，要求对分析方法进行验证、证实或重新验证：

首次用于常规检测前

转到另一个实验室时

对于验证过的方法，其条件或方法参数发生变化时（例如，仪器性

能参数发生改变或样品基质不同时），并且这种变化超出了方法的原

适用范围

从文献可以看出，行业委员会和监管机构对方法验证相当重视。本章

概述了方法验证对于获得高质量数据有怎样的帮助（还有其他因素，

将在以后阐述）。

213本书主要讲述实施方法验证的概念和策略。书中并不详细阐述方法验

证的细节。不过，读者可以找到这方面的各种信息和指南，有研究机

构发布的研究成果，也有个人作者发表的文章。本章对这些文献作一

综述。与分析方法转移以及一些特征参数有关的其他参考文献参见相

关章节。

英国政府检测标准集团（The Laboratory of the Government Chemist,

LGC）制定了实验室内部方法验证指南1，其中包含了对实验室认可

相关要求的讨论

美国食品药品管理局（US FDA）制定了两个行业指南，分别是分析方

法验证2和是生物分析方法验证3

ICH出版了两个方法验证指南。Q2A4给出了验证中必须考虑的8种

验证参数的术语和定义。Q2B5中包含了方法学内容，但是同时声明

允许一定的灵活性：“申请人有责任选择最适合其产品的验证步骤和

方法。”

IUPAC6出版了“单个实验室分析方法验证的协调指南”

EURACHEM7出版了方法验证的详细指南。这是最详尽的官方指南，

包含了方法验证的理论和实践。它最初是为ISO/IEC认可实验室制

定的，但是由于其全面性，也成为（生物）药物实验室很好的参考

资料

Huber8著有分析实验室验证参考书，其中有一章就是方法验证

AOAC9出版了按ISO 17025认可要求进行分析方法证实的技术文件

Viswanathan及共同作者10

撰写了生物分析方法验证的综述1

1.1 文献综述1

对于分析方法的验证和证实，存在很多有关这两个术语的讨论，它们

也经常被交叉互用。USP通则<1225>和<1226>中解释了这两个术语

的差异。通则<1225>11的标题是：“法定方法的验证”。它阐述了分析

方法的验证，包括从建立方法开始的所有验证参数，结果得到某一特

定样品的验证方法。这一过程建议用于内部制定方法的验证。

通则<1226>12题为“法定方法的证实”。它建议在应用法定方法时，

应证明实验室有能力成功应用该方法。在方法转移时，接受方法的实

验室也应进行方法证实。本书在后面将对法定方法的证实和方法转移

展开讨论。

验证分析方法的目的是证明“预期目标的适用性”。分析测量的目的

是产生准确可靠的数据。只有方法验证无法保证这一目标的实现，但

是应当将其作为分析测量质量保证体系的一部分。USP通则<1058>分析仪器确认中明确提出了这一点13。该通则开头部分讨论了实验室

数据质量的不同要素的重要性，其中还解释了为何系统适用性试验或

质量控制图的分析不足以确保分析检测结果的准确可靠，仪器确认和

方法验证同样重要。

图1揭示了影响数据质量的不同因素：分析仪器确认、分析方法验证、

系统适用性试验以及通过质控样品进行分析质量控制。

41.3

实验室数据质量的要素1.2 术语：验证与证实

1

5仪器确认意味着仪器有确定的技术指标、经过检测并证实其适用于需

要验证的方法。接着，在经过确认的仪器上验证分析方法，证明其按

预期要求运行。这个过程不依赖于任何特定的仪器。如果我们希望方

法能在不同厂家的仪器上使用，也应使用那些仪器进行方法验证。

这之后，在特定的仪器上应用具体的方法进行系统适用性试验。系统

适用性参数应在方法验证时加以选择。系统适用性试验的成功运行确

保整个系统在特定的检测条件下符合分析人员的预期目标。

最高级别的测试是对质量控制样品的分析。分析已知含量的标准品或

样品，并将分析结果与已知值进行比较。󱋊󰬉󰩦󱋆󰥠󰖱

󱀣󰽥󰹢󱆌󱂠󰹬󱄓

󰝴󱀆󰝛󰝆󱄓󱊤

󰝴󱀆󱅏󰴗󰶓󰶫󱊤󰹍󱄣󰳗󰝴󱀆󰚦󱌚󰶓󱂠

󱊤󰹍󱀣󰽥󱈏󱂜󰱀󰠕󰙳󰚟󰝴󱀆󰶧󱇵󰚦󱇨󰳺󰰣Ք

󱊤󰯽󰝴󱀆󰝛󰝆󰱀󰠕󰹍󱁄󱇨󰳺󰰣󰚦

󱊤󰯽󱅏󰴗󰹢󱆌󱇨󰳺󱆩󰽰

图1. 分析数据质量的影响因素1

方法验证在分析仪器确认和系统适用性试验之间进行，并与其他质量

要素相联系。分析方法应使用经过确认的仪器进行验证。通过方法验

证，应确定系统适用性试验和质量控制检查的参数和接受限度。

62法规和质量管理标准

82

2.1 美国食品药品监督管理局

（FDA）对分析实验室有影响的法规和质量管理标准都要求进行分析方法验证。

有的法规中直接使用“验证”一词，并列出特定参数，也有的法规用

这样的陈述暗示验证要求——“检测方法应适合于预期用途。”本章对

最为重要的法规、质量标准和官方指南进行综述。验证要求指南出自

各类不同的机构，但验证目的都是为了获得有效的分析检测结果。这

对于通过分析检测来确保产品质量和安全而言是非常重要的。

cGMP（药品动态生产质量管理规范）14和GLP（临床前研究实验室质

量管理规范）等法规要求必须进分析方法的验证。美国cGMPs在

211.165(e)和211.194两小节中提出了验证要求：

165(e)：公司应用检测方法时，应建立并记录准确度、灵敏度、

专属性以及重现性。这类验证及文件制作应按194(a)(2)完成

194(a)(2)：实验室的记录应包含用于样品检测的每个方法的声明。

声明中应指明建立方法的数据位置，这些数据应能证明该检测方法

在应用于产品检测时符合特定的准确度和可靠性标准要求。所有检

测方法的适用性应在实际应用条件下得到证实

194(b)：如对应用于检测的已确认方法有任何变更，应保存完整的

变更记录。该记录中应包含变更原因以及相关数据，以证实方法变

更后的样品检测结果至少能达到原方法相同的准确度和可靠性

FDA GLP法规21 CFR第58部分15并未用到“验证”一词，但是依据

58.113中的要求，检查员需要检查验证研究记录：“应采用合适的

分析方法进行检测”，其中“合适的”即意味着验证。并且FDA的

生物分析方法验证指南3

中规定临床前毒理研究也属于验证范围9FDA关于生物利用度和生物等效性要求的法规21 CFR 32016第29节中规定：(a) 用于体内生物利用度研究以检测体液或排泄物中活性

药物成分或治疗成分检测的分析方法，或用于急性药理作用检测的

方法，应证明其具有准确性和足够的灵敏度以及恰当的精密度，能

满足体内的活性药物成分/治疗成分或其代谢产物的实际浓度的检测

要求。

PIC/S的使命是“领导制定、实施和维护国际性的、统一的药品生产

质量管理规范（GMP）标准以及药品领域检查工作质量体系”。

这一使命通过以下手段得以实施：制定和推广统一的GMP标准和指

导文件；培训主管部门、尤其是检查员；评审（和复评审）检查活动；

以及促进主管部门和国际组织的合作和网络化。2009年11月，有36个政府组织参加了PIC/S，包话所有的欧盟成员国。很多国家的政府

机关申请加入PIC/S，包括美国FDA。许多新的成员国还没有按照

PIC/S GMPs17建立自己的GMP法规。PIC/S的GMP与欧盟的GMP指

令18非常相似。

例如，两个文件都在第6.1.5部分以相同的文字规定了分析方法验证

的要求：

分析方法应进行经过验证。申请上市许可的所有检测均应按照批准

的方法进行2

2.2 药品检查协定和药品监察检查合

作计划(PIC/S)和欧洲2

在PIC/S的实验室现场检查指南第8.7小节19中有很多的详细信息与

检查员希望了解的情况有关。该指南中包含检查员检查质量控制实验

室时的一些提问。这些问题包括：

方法验证是不是验证总体计划的一部分？

有没有通用的方法验证SOP？方法验证报告是否经过正式批准？

是否明确验证目的？

是否按ICH5规定的参数对每一种方法进行完整的验证并记录？

是否规定了每种方法的接受限度并能符合该限度规定？

有无分析方法转移的SOP？

国际协调会议（ICH）发起于1990年，汇集了欧盟、日本和美国的监

管机构和这三个地区的制药行业专家，一起讨论产品注册方面的科学

和技术问题。

ICH出版的指导原则，有些被成员国（如欧盟）写入法律，有些被国

家权力机构（如美国FDA）推荐为指南。

其中，最为重要的ICH文件是活性药物成分的GMP指南20。在第12章中规定了方法验证的要求：

应对分析方法进行验证，所用方法收载于相关的药典或其他认可的

标准参考文件中的除外。所有检测方法均应在实际使用条件下证实

其适用性

实施分析验证的程度应能反映分析的目的以及活性药物成分的生产

工艺状况

开始验证分析方法前，应考虑对分析设备进行适当的确认

102.3 国际协调会议（ICH）2

11美国药典（USP）为具体的应用制定方法，并针对FDA监管的行业内

不同的分析特点制定通则。根据联邦食品药品和化妆品法案501部分

的规定，USP方法构成法定标准。USP制定了两个与方法验证有关的

通则，还有一个通则中允许不经过验证变更方法。

通则<1225>是“法定方法的验证”11。该通则中给出了用于新方法

验证的各种参数。通则中的建议可以被药品实验室用作自行制定方

法的验证

通则<1226>是“法定方法的证实”12。本通则用于实施药典和标准

方法的实验室。这些内容也适用于实验室应用其他实验室验证过的

方法

通则<621>为“色谱法”21。本通则中有一些有用的建议，是关于

如何调整或改变GC和HPLC方法而无需重新验证的

ISO/IEC 17025是与化学实验室最为相关的ISO标准22。它规定了检测

和/或校准实验室能力的通用要求。该标准作为质量体系标准，在环境、

食品、化学和临床实验室得到了广泛应用。它被用于对那些寻求认可

地位的实验室进行评审。

标准中有许多要求与本书的主题有关。最为重要的要求见5.4.5：

实验室应对非标准方法、实验室设计（制定）的方法、超出其预定

范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法进行确认，以证实

该方法适用于预期的用途

在引入检测或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准

方法2.4 美国药典（USP）

2.5 ISO/IEC17025

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分析方法验证

分析方法验证

新药申报时，药品质量标准中分析方法必须验证；药物生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法必须进行验证。

一、分析方法学验证事项

药物分析检验时药品生产的GMP的药物分析的方法学验证，是保证药物分析结果准确性的前提和基础，也是实现药物分析检测GMP的必然要素。构成药物分析中的检测方法验证，这要涉及到以下些方面的内容：

1、分析方法验证成功的前提条件：（1）仪器已经确认、校正并在有效期内 （2）经过培训的人员（3）可靠稳定的对照品

（4）可靠稳定的实验试剂（5）确认受试溶液的稳定性，在规定时间内无降解。

2、分析方法学验证所要求验证的内容：（1）含量的测定 （2）杂质的含量测定 （3）药物的定性鉴定 （4）药物的含量均匀度测定 （5）药物的微生物检测 （6）药物的细菌内毒素的检测

验证内容准确度：准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。测定回收率R（recovery）的具体方法可采用加样回收试验法来进行测定。加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。数据要求:规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次

精密度：（重复性、中间精密度和重现性精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。

（1）重复性(repeatability):在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价（2）中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度（3）重现性(reproducibility)不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度（4）数据要求：需报告SD，RSD和可信限。

安捷伦高效液相色谱仪最新验证方案

安捷伦高效液相色谱仪最新验证方案

第 1 页 共 16 页

Agilent1200高效液相色谱仪

验证方案

类 别： 编 号：

部 门：验证委员会 页 码： 共16页，第1页

版 次：  新订  替代：

起草部门： 年 月 日

审核： 年 月 日

审阅会签：

（验证委员会）

批 准： 年 月 日

实施日期： 年 月 日

复印数：

批准：

分发至：

第 2 页 共 16 页 目 录

1． 概述………………………………………………………………………………………………………3

2． 验证目的…………………………………………………………………………………………………3

3． 验证依据及验证范围……………………………………………………………………………………3

4． 验证工作小组……………………………………………………………………………………………3

5． 验证方案审批……………………………………………………………………………………………3

5.1验证方案起草……………………………………………………………………………………………3

安捷伦气相色谱质谱仪方法建立

安捷伦气相色谱质谱仪方法建立

安捷伦气相色谱质谱仪方法建立

安捷伦（Agilent）气相色谱质谱联用仪（GC-MS）是一种用于分析复杂样品的常用仪器。下面将详细介绍建立安捷伦气相色谱质谱仪方法的步骤。

首先，建立方法前需要准备样品和标准品。样品应根据分析对象的不同而采取不同的准备方法，包括提取、净化等步骤。标准品是为了建立定量分析方法而需准备的，应根据需要选择合适的标准品。

其次，选择气相色谱柱。根据待分析物的特性和分离要求，选择合适的色谱柱。色谱柱的选择应考虑其分离效果、耐受性和使用寿命等因素。

接着，设置气相色谱仪条件。对于安捷伦气相色谱仪，应设置合适的进样方式、进样量、进样温度等参数。此外，还需要设置侦测器的工作参数，确保信号稳定且符合分析要求。

然后，选择合适的质谱条件。质谱条件包括选择合适的离子源、离子化方式、扫描模式等。离子源的选择应根据样品的特性确定，常用的有电子轰击离子源（EI）、化学电离源（CI）等。离子化方式可选择正电离或负电离，具体选择根据目标化合物的性质决定。扫描模式可选择全扫描或选择离子监测（SIM）等，根据分析要求进行相应的选择。

建立方法后，需要进行方法的优化和验证。优化方法可通过调整柱温程序、进样参数等方法进行。验证方法可通过分析合适的质控品，检验方法的准确性、精密度和重复性，并计算相应的校正因子和相对标准偏差等性能指标。 最后，进行样品分析。根据建立的方法和优化验证的结果，对待测样品进行分析，并记录检测结果。对于定量分析，可通过内标法或外标法进行准确测定。

总之，建立安捷伦气相色谱质谱联用仪方法是一个综合性的工作，需要充分考虑样品特性、色谱柱选择、仪器条件设置、方法优化和验证等方面的因素。合理建立的方法可以为后续的样品分析提供准确和可靠的结果。

安捷伦应用解决方案 婴儿奶瓶浸出的双酚 A 的分析

安捷伦应用解决方案 婴儿奶瓶浸出的双酚 A 的分析

安捷伦应用解决方案

婴儿奶瓶浸出的双酚 A 的分析

应用简报

消费品

摘要

双酚 A 可以从食品容器的塑料表面浸出，在多种基质如血浆、尿液和地下水中均被检出。它是一种内分泌干扰物，能够模拟婴儿自身的激素（如雌激素），可能会对健康产生不良影响。本应用简报将介绍一种婴儿奶瓶中提取的双酚 A 及其结构类似物双酚 F 的定量方法。我们使用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱，在 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统上开发了此方法。通过部分方法验证以确证方法的线性、稳定性及峰面积和保留时间的精密度。使用 Agilent 7696A 样品制备工作台自动进行系列稀释，可节省分析时间。结果表明，双酚 A 的定量限 (LOQ) 为 1.06 ng/mL。样品回收率研究表明，所得双酚 A 的回收率为 80%。利用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统将本方法转移至超高效液相色谱 (UHPLC)。UHPLC 方法所采用的实验条件相同，色谱峰更窄更高，分离度更好，并且信噪比也有所改善。这两种方法均可应用于双酚 A 的定量分析，实现食品容器（例如，婴儿奶瓶）的质量控制。作者

Syed Salman Lateef安捷伦科技有限公司印度班加罗尔前言

双酚 A (BPA) 是一种用于制造聚碳酸酯塑料和环氧树脂的单体。在不同环境条件下，如受热或改变 pH，痕量 BPA 能够从聚碳酸酯塑料表面浸出，最终进入到人体中。BPA 在诸如尿液、地下水和血浆等不同基质中被检出。基于在阈值以上可观察到毒性作用的假设，美国国家环境保护局 (US EPA) 规定每人每天的 BPA 参考剂量 (RfD) 为 50 µg/kg.bw1。使用聚碳酸酯塑料制造的奶瓶对儿童具有潜在的风险。在本应用简报中，我们使用市售的结构类似的化合物双酚 F (BPF)（图 1）与 BPA 一同分析以确定分离效率。

Ballesteros-Gomez 等人对用于分离、鉴别和定量 BPA 的分析方法进行了综述2。此外，ASTM 标准检测方法 D 7574-09 利用离线 SPE 法从环境水样中提取双酚 A3。BPA 是一种荧光化合物，荧光检测器 (FLD) 可以灵敏地测定奶瓶浸出的 BPA 浓度。本应用简报介绍了一种结合离线 SPE 和 (U)HPLC/FLD 对 BPA 和 BPF 同时定量分析的方法。实验部分