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荧光素酶报告基因步骤
荧光素酶报告基因是分子生物学实验中常用的工具，它可以用
来标记目的基因，以便研究该基因在细胞或生物体中的功能。
本
文将介绍荧光素酶报告基因的步骤。
一、选择适当的报告基因
在生物学研究中，常用的报告基因有GFP（绿色荧光蛋白）、luciferase（荧光素酶）等。
选择适当的报告基因需要考虑许多因素，例如研究目的、检测灵敏度等。
二、构建荧光素酶报告基因表达载体
将所选择的报告基因与荧光素酶的编码序列连接在一起，构建
荧光素酶报告基因表达载体。
该载体可用于后续的质粒转染实验。
三、转染表达载体
将构建好的荧光素酶报告基因表达载体转染至所需的细胞或生
物体中，使其表达。
转染方法包括电穿孔法、化学法、病毒载体
介导转染等。
四、用荧光素酶检测目的基因的表达
在实验中使用荧光素酶底物（如荧光素或共轭体H）进行检测，以判断目的基因在细胞或生物体中的表达水平。
五、分析实验结果
通过荧光素酶检测的实验结果，可以确定目的基因在细胞或生
物体中的表达情况。
若荧光素酶信号的强度高，则说明目的基因
表达较多；若荧光素酶信号的强度低，则说明目的基因表达较少。
总结
以上就是荧光素酶报告基因的步骤。
它是分子生物学研究中常
用的一种技术，可以用来研究基因在细胞或生物体中的表达情况。
在实际操作中，还需要根据需要进行优化和调整。
生命活动中的一系列重要过程如细胞增殖、分化等是通过基因表达来实现的，这种基因表达控制首先通过特定转录因子在转录水平上进行。
核转录因子(nuclear transcription factor)是一类蛋白质，它们具有和某些基因上启动子(promotor)区的固定核苷酸序列结合，而启动基因转录的功能。
核转录因子kappa B(NF-κB)是其中重要的一组蛋白质，也是一类重要的转录激活因子，广泛存在于各种真核细胞中【1】。
1986年，Sen 等【2】首次从鼠B淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，•称之为NF-κB。
它们可以调节许多与免疫功能和炎症有关的基因，在机体生理和病理条件下，发挥重要的功能。
现已表明NF-κB的功能涉及到免疫反应、胸腺发育、胚胎发生、炎症和急性反应、细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染等多种病理过程。
1. NF-KB的概述1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及结构在哺乳动物细胞中共有五种NF-κB家族成员【3】，它们是原癌基因C—Rel、NF—κB1(p50／p105)、NF—κB2(p52／p100)、Re1A(p65)、RelB。
这些蛋白都有一个大约由300个氨基酸组成的氨基末端，称为Rel同源区(Rel homogeneous domain，RHD)或NRD(NF—κB／Rel／dorsa1)。
其RHD内含DNA结合区，二聚体化区和核定位序列，分别具有与DNA -κB序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与NF-κB抑制蛋白（IKB）家族成员相互作用并携带核定位信号（NLS），参与活化的NF-κB由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。
根据结构、功能和合成方式的不同，Rel蛋白分为两类。
•一类为P50(•NF-•KB1）和P52(•NF-•KB2），•分别由含有C-末端锚蛋白重复序列（ahkrin ••repeat motif）的前体蛋白p105和p100通过ATP依赖蛋白水解过程裂解而形成。
转录因子的作用与应用转录因子是一种能够直接或间接影响基因表达的蛋白质，通过结合DNA的特定序列并调节转录过程来实现这种影响。
这种调节作用在生命科学领域中非常重要，因为它关系到细胞增殖、分化、成熟、抗病抗逆等方面。
本文将从转录因子的基本概念、作用机制、研究方法、应用现状四个方面，对转录因子进行介绍。
一、基本概念转录因子是参与基因转录的一种蛋白质，在转录因子的帮助下转录起始复合物、活性转录酶等一系列因子能够转录目标基因，因此转录因子在基因表达调控中起着关键性作用。
转录因子有一些典型结构域，如DNA结合结构域（DBD）、转录调控域（TAD）等。
其中，DBD是控制特异性的关键，不同的DBD结合不同的DNA序列。
DBD结合的DNA序列常常是一个序列特异性、高度保守的DNA单元，称为转录因子结合位点（TFBS）。
二、作用机制转录因子的作用机制非常复杂。
一般来说，转录因子的结合改变了DNA序列的局部结构，从而影响RNA聚合酶的结合。
具体来说，转录因子在启动子的TFBS上结合，招募RNA聚合酶，在启动子区域的催化区域上切断DNA链、形成RNA链以完成转录的过程。
不同的转录因子在细胞增殖、分化、成熟、抗病抗逆背景下的调节方式不同。
例如，转录因子p53在DNA损伤后能够促进基因p21表达，抑制细胞增殖和周期进程；而转录因子NF-κB参与抗病抗病毒过程，激活相关基因的表达。
三、研究方法转录因子研究方法主要包括：特异性转录因子基因的克隆、表达、纯化和DNA结合活性的检测等些方面。
常用的技术有：1.膜上杂交检测法：元件为核酸探针或 PMT探针。
通过利用核酸的互补配对的特性，把核酸探针或 PMT探针固定于膜上，然后与荧光标记的标本（DNA或 RNA）进行杂交反应，最后通过荧光信号来检测特定转录因子的结合。
2.荧光素酶报告基因法：将干扰素-β基因转录起始点的启动子与luciferase荧光素酶报告基因进行构建，然后在转染RIG-I、MAVS等相关基因时检测luciferase的表达水平，得出转染的效果和生理学效应。
目录摘要 (I)Abstract (III)英文缩略语 (V)引言 (1)文献综述 (2)1NF-κB细胞信号通路简介 (2)1.1NF-κB的结构 (2)1.2NF-κB信号通路的激活 (3)1.3NF-κB抑制 (4)2NF-κB与癌症 (4)2.1NF-κB与癌症的关系 (4)2.2作用于NF-κB靶向的药物研究应用现状 (5)3报告基因 (6)3.1报告基因简介 (6)3.2报告基因的应用现状 (7)实验研究 (8)第一章报告基因靶向NF-κB的抑制剂高通量筛选模型的建立及应用 (8)1材料 (8)1.1实验仪器 (8)1.2试剂试药 (8)1.3细胞株 (8)1.4相关溶液的配制及使用： (8)2方法 (9)2.1细胞的基础培养、传代、复苏、冻存 (9)2.2质粒的扩繁 (10)2.3转染条件的建立 (11)2.4基于报告基因靶向NF-κB的抑制剂的筛选 (12)2.5实验数据处理及统计分析 (13)3.1Hek293T细胞培养结果 (14)3.2质粒的扩繁浓度及纯度考察结果 (14)3.3转染条件的优化结果 (15)3.4基于NF-κB报告基因靶向抑制剂的筛选结果 (17)4小结 (22)第二章基于NF-κB信号通路的竹节香附素A抗肿瘤作用机制研究 (23)1材料 (23)1.1实验仪器 (23)1.2试剂试药 (23)1.3细胞株 (23)1.4相关溶液的配制 (23)2实验方法 (24)2.1人肝癌细胞QGY-7703细胞的培养 (24)2.2CCK-8法测定PDTC和竹节香附素A对QGY-7703细胞的增殖作用 (24)2.3竹节香附素A对NF-κB细胞信号通路作用研究 (24)2.4竹节香附素A对NF-κB p65及NF-κB p50的激活-核转运作用研究 (26)2.5竹节香附素A对NF-κB细胞信号通路蛋白表达情况研究 (27)2.6实验数据处理及统计学分析 (27)3.结果 (27)3.1人肝癌细胞QGY-7703细胞培养结果 (27)3.2CCK-8法测定PDTC和竹节香附素A对QGY-7703细胞的增殖抑制作用结果 (28)3.3竹节香附素A对NF-κB细胞信号通路基因表达的研究 (28)3.4竹节香附素A对NF-κB p65及NF-κB p50的激活-核转运作用研究结果 (30)3.5竹节香附素A对NF-κB细胞信号通路蛋白表达情况研究 (33)4小结 (33)第三章竹节香附素A联用地西他滨的抗肿瘤作用初探 (35)1实验材料 (35)1.1实验仪器 (35)1.2试剂试药 (35)2实验方法 (36)2.1竹节香附素A和地西他滨的抗肿瘤作用研究 (36)2.2竹节香附素A联合地西他滨对QGY-7703的侵袭、迁移作用研究 (36)2.3竹节香附素A联合地西他滨对QGY-7703细胞凋亡的影响 (37)2.4实验数据处理及统计分析 (37)3结果 (38)3.1竹节香附素A和地西他滨的抗肿瘤作用研究结果 (38)3.2竹节香附素A联合地西他滨对QGY-7703的侵袭、迁移作用研究结果 (39)3.3竹节香附素A联合地西他滨对QGY-7703细胞凋亡的影响结果 (44)4小结 (46)结论 (47)本文创新点 (49)参考文献 (50)致谢 (55)在学期间主要研究成果 (56)个人简介 (57)摘要目的：构建基于报告基因靶向NF-κB信号通路的抑制剂高通量筛选模型，筛选得到基于NF-κB信号通路的抗肿瘤活性成分，进而探讨活性成分的抗肿瘤机制及联合给药情况。
生命活动中的一系列重要过程如细胞增殖、分化等是通过基因表达来实现的，这种基因表达控制首先通过特定转录因子在转录水平上进行。
核转录因子(nuclear transcription factor)是一类蛋白质，它们具有和某些基因上启动子(promotor)区的固定核苷酸序列结合，而启动基因转录的功能。
核转录因子kappa B(NF-κB)是其中重要的一组蛋白质，也是一类重要的转录激活因子，广泛存在于各种真核细胞中【1】。
1986年，Sen 等【2】首次从鼠B淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，•称之为NF-κB。
它们可以调节许多与免疫功能和炎症有关的基因，在机体生理和病理条件下，发挥重要的功能。
现已表明NF-κB的功能涉及到免疫反应、胸腺发育、胚胎发生、炎症和急性反应、细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染等多种病理过程。
1. NF-KB的概述1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及结构在哺乳动物细胞中共有五种NF-κB家族成员【3】，它们是原癌基因C—Rel、NF—κB1(p50／p105)、NF—κB2(p52／p100)、Re1A(p65)、RelB。
这些蛋白都有一个大约由300个氨基酸组成的氨基末端，称为Rel同源区(Rel homogeneous domain，RHD)或NRD(NF—κB／Rel／dorsa1)。
其RHD内含DNA结合区，二聚体化区和核定位序列，分别具有与DNA -κB序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与NF-κB抑制蛋白（IKB）家族成员相互作用并携带核定位信号（NLS），参与活化的NF-κB由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。
根据结构、功能和合成方式的不同，Rel蛋白分为两类。
•一类为P50(•NF-•KB1）和P52(•NF-•KB2），•分别由含有C-末端锚蛋白重复序列（ahkrin ••repeat motif）的前体蛋白p105和p100通过ATP依赖蛋白水解过程裂解而形成。
NF-κB相互作用多肽原核表达载体的构建、表达与纯化史海水;梁华平;徐祥;李生茂【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2005(025)005【摘要】为了获得高纯度的可溶性NF-κB相互作用多肽,首先以酵母双杂交技术筛选获得的NF-κB相互作用多肽的酵母表达质粒pGAD GH/pp10为模板,扩增多肽基因片段,后经BglⅡ,StuⅠ双酶切后连接到pET-42a(+)载体中,构建GST/多肽融合蛋白的原核表达载体,并将GST/多肽融合蛋白的原核表达载体转化入BL-21菌株,用0.4 mmol/L IPTG于30 ℃诱导表达4 h,后经GST亲和纯化GST/多肽融合蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的表达和纯度.实验结果表明,成功地构建了NF-κB相互作用多肽的GST/多肽融合蛋白原核表达载体,进行了GST/多肽融合蛋白的诱导表达,融合蛋白的表达为可溶性表达,最终纯化获得纯度约为80%的可溶性GST/多肽融合蛋白,这将为后继利用GST pull-down,Bio-sensor,EMSA等实验进一步验证NF-κB相互作用多肽的功能提供可靠的材料来源奠定基础.【总页数】5页(P530-534)【作者】史海水;梁华平;徐祥;李生茂【作者单位】河北医科大学,生物化学教研室,河北,石家庄,050017;第三军医大学,大坪医院野战外科研究所第一研究室,重庆,400042;第三军医大学,大坪医院野战外科研究所第一研究室,重庆,400042;第三军医大学,大坪医院野战外科研究所第一研究室,重庆,400042;第三军医大学,大坪医院野战外科研究所第一研究室,重庆,400042【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q51【相关文献】1.汉滩病毒核蛋白羧基端多肽原核表达载体的构建及表达 [J], 李光玉;黄长形;潘蕾;牟丹蕾;李新红;张颖;杨为松;白雪帆2.A组链球菌M蛋白重组多肽原核表达载体构建及融合蛋白的表达 [J], 丁月霞;倪琼琼;刘金来3.人野生型S100A10原核表达载体的构建、蛋白表达纯化及鉴定 [J], 王德利;尹显贵;杨华;李赫4.云红梨1号HY5基因原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 苏俊;陈璐;马伟荣;杨谨;黄兴龙;陈霞;舒群5.APEC毒力基因ygeG的原核表达载体构建、表达纯化及鉴定 [J], 姜楠;郑倩倩;李倩文;涂健;宋祥军;邵颖;刘红梅;祁克宗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910324921.6(22)申请日 2019.04.22(71)申请人 中国食品药品检定研究院地址 102629 北京市大兴区华佗路31号申请人 信达生物制药（苏州）有限公司(72)发明人 王军志 王兰 于传飞 李萌 郭允籣 (74)专利代理机构 北京预立生科知识产权代理有限公司 11736代理人 高倩倩 李红伟(51)Int.Cl.C12N 15/85(2006.01)C12N 5/10(2006.01)C07K 16/28(2006.01)G01N 33/68(2006.01)G01N 33/569(2006.01)(54)发明名称一种检测抗OX40抗体的方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种检测抗OX40抗体的方法及其应用，所述方法是基于构建Jurkat -OX40-NFκB -Luc单克隆细胞系所建立的生物活性检测方法，该方法可以快速方便的检测抗OX40抗体，具有较高的特异性、敏感性、准确性和精密性。
本发明同时公开了检测含有报告基因的高表达OX40的单克隆细胞株及其构建方法。
权利要求书1页 说明书8页 附图3页CN 110004177 A 2019.07.12C N 110004177A权 利 要 求 书1/1页CN 110004177 A1.一种测定抗OX40抗体生物活性的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：a.将连接有OX40的载体转染到细胞中，加压筛选出高表达OX40的细胞株；b.以含荧光素酶报告基因的质粒为载体，连接NF-κB的反应元件，构建含NF-κB基因的重组质粒；c.将b中的重组质粒转染到a中筛选出的高表达OX40的细胞株中，加压筛选出高表达荧光素酶的细胞株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞株包括Jurkat细胞、HUVEC细胞、293细胞、COS7细胞、L929细胞、HepG2细胞、CHO细胞、3T3细胞；优选的，所述细胞为Jurkat细胞。
nf-kb荧光素酶报告基因NF-kB是一种重要的转录因子，它在许多生理和病理过程中起着重要的调控作用，包括免疫反应、细胞凋亡和炎症反应。
为了研究NF-kB的活性和调控机制，科学家们发展了许多方法，其中一种常用的方法是使用nf-kb荧光素酶报告基因。
NF-kB荧光素酶报告基因是一种能够表达荧光素酶（Luciferase）的基因。
荧光素酶是一种广泛用于生物荧光成像的酶，它能够产生荧光素酶反应，从而发出可见光。
通过将nf-kb荧光素酶报告基因导入细胞中，可以通过测量荧光素酶的活性来间接评估NF-kB的活性水平。
下面是使用nf-kb荧光素酶报告基因研究NF-kB活性的步骤：1.构建nf-kb荧光素酶报告基因载体：首先，需要设计和合成包含nf-kb启动子的荧光素酶报告基因载体。
这个启动子区域是NF-kB的调控区域，可以被NF-kB结合并调控报告基因的表达。
载体的构建可以使用分子克隆技术，将荧光素酶基因与nf-kb启动子连接起来。
2.转染nf-kb荧光素酶报告基因载体：将构建好的nf-kb荧光素酶报告基因载体导入目标细胞中。
转染可以使用多种方法，包括化学法、电转法和病毒载体介导的转染等。
确保尽可能高的转染效率，以获得准确的荧光素酶活性结果。
3.激活NF-kB：为了研究NF-kB的活性调控，需要引起NF-kB的激活。
可以使用不同的方法来激活NF-kB，例如使用细胞因子（如肿瘤坏死因子α）刺激、通过化学品（如PMA）处理细胞等。
根据具体实验设计和研究需要，选择适当的激活方法。
4.测量荧光素酶活性：在激活NF-kB后，可以通过测量荧光素酶的活性来评估NF-kB的活性水平。
荧光素酶活性可以使用荧光素酶底物来检测，它会与荧光素酶反应并发出可见光。
荧光素酶反应可以使用荧光素酶检测试剂盒来进行，根据说明书中的步骤操作即可。
5.数据分析：通过测量荧光素酶活性的强度，可以得到关于NF-kB活性的信息。
可以将荧光素酶活性与不同处理组进行比较，如对照组和实验组。
激光生物学报ACTA LASER BIOLOGY SINICAVol. 31 No. 6Dec. 2022第31卷第6期2022年12月收稿日期：2022-09-07；修回日期：2022-10-24。
基金项目：国家自然科学基金项目（81773169）；湖南省自然科学基金面上项目（2020JJ 4180）。
作者简介：王瑞萍，硕士研究生。
* 通信作者：谭拥军，教授，主要从事肿瘤基因治疗的研究。
E-mail:*************.cn 。
基于NF-κB 荧光蛋白报告基因抗肿瘤药物筛选平台的建立王瑞萍，程浩杰，余 雳，黄明敏，谭拥军*（湖南大学生物学院，长沙 410082）摘 要：采用基因工程技术构建绿色荧光蛋白（GFP ）报告基因质粒，有利于活细胞成像、蛋白质印迹（WB ）、细胞流式分析及活细胞示踪等，从而对抗肿瘤药物进行筛选。
利用聚合酶链反应（PCR ）扩增NF-κB 基因的启动子序列以及GFP 基因片段，将其克隆到pGL 6-Enhancer 载体中，通过菌落PCR 检测、酶切鉴定和测序证明了质粒构建成功。
然后，将构建的质粒转染到HEK-293T 细胞中，根据活细胞荧光成像、WB 及流式细胞分析验证，构建的报告基因质粒在细胞内可正常表达。
选择抗肿瘤药物雷帕霉素、紫杉醇、吉西他滨，以及本实验室正在研究开发的多肽类抗肿瘤药物M 1-20、M 1-21验证报告基因体系试验，发现构建的报告基因质粒可以响应药物对细胞的影响。
该药物筛选平台的建立为研究抗肿瘤药物对供试细胞的影响提供了良好的试验技术体系，同时，也为构建活细胞示踪体系提供了材料。
关键词：报告基因；启动子；分子克隆；抗肿瘤药物；药物筛选平台 中图分类号：Q 78；R 73 文献标志码：A DOI ：10.3969/j.issn.1007-7146.2022.06.004Establishment of Anti-tumor Drug Screening Platform Based on NF-κBFluorescent Protein Reporter GeneWANG Ruiping , CHENG Haojie , YU Li , HUANG Mingmin , TAN Yongjun *(College of Biology, Hunan University, Changsha 410082, China)Abstract: Using genetic engineering technology, the green fluorescent protein (GFP) reporter gene plasmid was constructed,which is convenient for live-cell imaging, Western blot (WB), cell flow analysis and live-cell tracing, so as to realize the screen-ing of anti-tumor drugs. The promoter sequence of NF-κB gene and GFP gene fragment were amplified by polymerase chain reaction (PCR), cloned into the pGL 6-Enhancer vector, and the plasmid construction was proved by colony PCR, digestion iden-tification and sequencing. The successful plasmid is then transfected into HEK-293T cells, and the reported plasmid is normally expressed within the cell based on live-cell fluorescence imaging, WB and flow cytometry. Finally, the anti-tumor drugs rapamy-cin, paclitaxel, gemcitabine, and the peptide anti-tumor drugs M 1-20 and M 1-21, which were being developed in our laboratory, were selected to verify that the gene system can respond to the effects of the drug on cells. The establishment of this drug screen-ing platform provides a useful tool for studying the effects of anti-tumor drugs on cells, and also provides materials for building a live cell tracer system.Key words: reporter genes; promoter; molecular cloning; antitumor drug; drug screening platform （Acta Laser Biology Sinica , 2022, 31(6): 506-511）507第6期近年来，随着恶性肿瘤的发病率逐渐增高［1］，癌症成为仅次于心脑血管疾病致死率第二的“杀手”，使人类健康受到严重的危害，因此，抗肿瘤药物的研发迫在眉睫。
