玉米叶片叶绿素的提取和测定摘要：利用80%的丙酮提取玉米叶片中的叶绿素，再利用分光光度计测定在663nm和645nm特征波峰下的光密度值，进一步算出玉米叶绿素的含量。
关键词：叶绿素；提取；含量测定Abstract: corn leaf chlorophyll were extracted by 80% acetone, and then the optical density were measured at the wave length of 663 and 645 nm by spectrophotometer．According to the related formulation we can circulate the Chlorophyll content.Key words: Chlorophyll，Withdraws，Determination绿色植物吸收阳光能量，同化二氧化碳和水，制造有机物质并释放氧气的过程，称为光合作用。
光合作用所产生的有机物质主要是糖类。
光合作用能把无机物变成有机物，能蓄积太阳能，还能保护环境。
这一切都离不开叶绿素体这个细胞器，而组成叶绿体的主要成分之一是叶绿素，叶绿素的作用就是先吸收太阳光能[5] ，然后固定CO2并与H2O同化有机物质。
除了在光合作用中起作用之外，叶绿素对人体也有相当大的作用。
比如：造血作用（叶绿素中富含微量元素铁，是天然的造血原料）、提供维生素、维持酶的活性、解毒作用（叶绿素是最好的天然解毒剂，能预防感染，防止炎症的扩散，还有止痛功能）、抗病强身（叶绿素在改善体质，祛病强身方面也有很多作用。
如能增强机体的耐受力；还有抗衰老、抗癌、防止基因突变等功能）。
叶绿素是植物中特有的一种成分，其他生物体内不含有叶绿素。
因此，其他生物体如动物是无法自身合成足够的能量，供给自体消耗和利用，只能从大自然中摄取，而植物就可以自供能量。
叶绿体中主要有叶绿素：叶绿素a和叶绿素b。
它们不溶于水，但能溶于酒精、丙酮和石油醚等有机溶剂。
在颜色上叶绿素a（C55H72O5N4Mg）呈蓝绿色，而叶绿素b（C55H70O6N4Mg）呈黄绿色。
叶绿素是叶绿酸的酯。
叶绿酸是双羧酸，其中的两个羧基分别与甲醇（CH3OH）和叶绿醇（phytol，C20H39OH）发生酯化反应，形成叶绿素[1]。
叶绿素分子含有4个吡咯环，它们和4个甲烯基（==CH—）连接成1个大环，叫做卟啉环。
镁原子居于卟啉环的中央。
另外有1个含羰基和羧基的副环（同素环V），羧基以酯键和甲醇结合。
叶绿醇则以酯键与在第IV吡咯环侧链上的丙酸相结合。
图１是叶绿素a的结构式。
叶绿素分子是一个庞大的共轭系统[7]，吸收光形成激发状态后，由于配对键结构的共振，其中1个双键的还原，或双键结构丢失1个电子等，都会改变它的能量水平。
叶绿素只以电子传递（即电子得失引起的氧化还原）及共振传递（直接传递能量）的方式，参与光反应。
叶绿素分子具有亲脂性。
有条长链的亲脂“尾巴”，对叶绿素分子在类囊体片层上的固定起着极其重要的作用。
叶绿素分子的“头部”是金属卟啉环，镁原子带正电荷，而氮原子则偏向于带负电荷，呈极性，因而具有亲水性，可以和蛋白质结合。
叶绿素分子的头部和尾部分别具有亲水性和亲脂性的特点，决定了它在类囊体片层中与其他分子之间的排列关系。
绝大部分叶绿素a分子和全部叶绿素b分子具有收集和传递光能的作用。
少数特殊状态的叶绿素a分子有将光能转换为电能的作用[3]。
图 1 叶绿素a的结构式图 2 叶绿体的亚显微结构1 实验材料与设备1.1 实验材料新鲜的玉米叶子（Corn leaf），去粗叶脉，清洗。
1.2 实验试剂丙酮：80%的丙酮和纯丙酮；碳酸钙少许；石英砂少许.1.3 实验仪器Eppendorf5804离心机、Eppendorf biophotometer分光光度计、天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管。
2 实验原理未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和叶绿素b，其原理：在混合中的两个组分，他们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分。
可根据Lambeer-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。
叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm,叶绿素b的最大吸收峰在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。
根据Lambeer-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系OD1=Ca*K al+Cb*K b1OD2=Ca*K a2+Cb*K b2叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数K值，如表１：表1：浓度为1g/L时,比吸收系数K值波长/nm 叶绿素a 叶绿素b663 82.04 9.27645 16.75 45.60将表中数值带如上式则得：OD663=82.04*Ca+9.27*CbOD645=16.75*Ca+45.60*Cb经过整理之后，既得到下式：Ca=0.0127OD663 -0.00269 OD645Cb=0.0229 OD645-0.00468 OD663如果把Ca，Cb的浓度从原来的g/L改为mgL，则上式可改写为下列形式：Ca=12.7 OD663-2.69 OD645（1）Cb=22.9 OD645-4.68 OD663（2）Ct=Ca+Cb=8.02 OD663+20.21OD645 （3）以上三个公式计算出叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的浓度（mg/L）3 方法与步骤3.1 色素的提取取玉米新鲜叶子，剪去粗大的叶脉并剪成碎快，称取2g放入研钵中加入丙酮20ml，少许的碳酸钙（加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。
原理如下：叶绿体中的色素所处的环境具微碱性，实验中，由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液流出，酸性的细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液的酸性，可起到保护叶绿素的作用）和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至80ml 。
并在观察其颜色。
3.2 测定光密度取上述色素提取液1ml ，加80%丙酮4ml 稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm 、645nm 出的光密度值 [6] 。
3.3 叶绿素的计算按公式（1）（2）（3）分别计算色素提取液中叶绿素a 叶绿素b 及叶绿素a 叶绿素b 的浓度。
再根据稀释倍数分别计算色素每克鲜重叶绿素的含量。
4 结果与分析4.1叶绿素提取试验的结果表2：试验的结果数据数据说明，玉米叶绿素的含量在0.3%左右。
在本次试验中，由于仪器问题第三组数据明显偏离过大，故计算平均值时只采用前两组数值，可得到玉米的叶绿素含量为0.307%。
4.2 叶绿素溶液的外观提取的 叶绿素的丙酮溶液为翠绿色。
如果为黄色等或者含有其他颜色的叶绿素溶液，则提取失败。
4.3 试验结果分析Ct （叶绿素的总含量测定值）mg/L获得率第一组20.63831 19.50248 9.75191 0.302% 第二组0.312% 第三组 0.156%通过本次试验，在叶绿素的提取中，由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮最终浓度近似80%。
也可以在配制80%丙酮溶液时，要大于80%，不能小于80%。
以达到提取溶液的精确度。
在叶绿素的提取试验中，要注意以下几点，由于叶绿素a、叶绿素b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果错误。
在测试第三次的时候，又从新调整了仪器的波长，虽然也是同样的数值，但是结果却相差很大。
制得的叶绿素提取液，应该盖紧盖子避光，以免接触空气破坏色素，影响实验效果。
光对叶绿素有破坏作用，实验操作应在弱光下进行，且应尽量在短时间内研磨；色素提取液若混有其他物质而造成浑浊，应重新过滤或离心，以免影响吸光度的测定，从而影响光密度的测定值；色素吸光度测定前，应按仪器说明及标准叶绿素 a 、b 对分光光度计的波长进行校正，否则影响叶绿素含量的测定精度[4]。
参考文献：［1］唐微,朱名安,刘俊C3 C4及CAM植物的光合速率日变化及叶绿素含量的比较(M) 湖北农业科学2002, 4［2］谢宇农生物教程(M) “叶绿素的提取和分离”实验方法的几点探索2004, 29(10)［3］罗红艺C3植物、C4植物和CAM植物的比较高等函授学报（M）2001, 05期［4］王金发，生物学精品课程。
试验十九叶绿素的提取. 2003年10期［5］王金发，细胞生物学 [Ｍ]. 第八章叶绿体的光合作用北京：科学出版社. 2004.9［6］董无彦，左贤云，邬荆平，无机化学[J]. 第十五章吸光光度法分光光度计的应用北京：科学出版社.[7] 夏百根,黄乾明,有机化学[M],第二章二烯烃共轭体系北京:中国农业出版社[8]李得孝，侯万伟，员海燕西北农林科技大学学报[J] 玉米叶片叶绿素快速浸提方法研究2006, 34(11)[9] 宋开山，张柏，李方，段洪涛，王宗明作物学报[J] 玉米叶绿素含量的高光谱估算模型研究, 2005,31 (8) ,1095-1097[10]李得孝, 郭月霞,员海燕,张敏,龚小艳,穆芳中国农学通报[J] 玉米叶绿素含量测定方法研究2005, 21(6) ,153-155[11]张志良,植物生理学试验指导[M],第三章光合作用北京:高等教育出版社.[12]赵天宏沈秀瑛等杂粮作物[J] 水分胁迫及复水对玉米叶片叶绿素含量和光合作用的影响2003 ,23 (1) ,33-35[13] 技术与市场[J] 绿色食品系列2003, 5, 27-27[14] 张国民,徐丽梅黑龙江农业科学[J] 苗期低温对玉米叶绿素含量及生长发育的影响2000,1, 10-12[15]赵明,李少昆中国农业大学学报[J] 影响玉米单叶水分利用效率内在因素的研究1997, 2(1) ,89-94。
