土壤（Ｓｏｉｌｓ），２００８，４０（３）：３４４－３５０
变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术在土壤微生物多样性研究中的应用
辜运富 。张小平 ，涂仕华
（１四川农业大学资源环境学院微生物系。Ｉ￣／１１雅安６２５０１４； ２四川省农业科学院土壤肥料研究所。成都６１００６６）
摘要： 应用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）谱图分析技术对土壤微生物多样性进行描述，可以克服传统微生物分离纯化
培养方法和显微技术的局限性。本文介绍了变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析方法及其在土壤微生物多样性中的应用。包括对土 壤特殊微生物生理类群，自然环境条件下微生物多样性变化，污染土壤微生物的多样性，不同种植制度下的土壤微生物多样性，
转基因植物、微生物介入的土壤微生物多样性等方面的研究。 关键词： 变性梯度凝胶电泳： Ｉ６Ｓ ｒＤＮＡ；ＰＣＲ： 土壤微生物多样性
中图分类号：Ｑ ９３８．１
土壤是微生物生活的大本营，蕴藏着丰富的微生
物资源，是微生物的菌种库，也是微生物研究领域的
一块“ｂｌａｃｋ ｂｏｘ”。土壤微生物多样性是生物多样性研
究的一个重要领域，研究土壤里的微生物群落结构演
替规律、微生物种群动态变化对于丰富现有微生物菌
种资源，保持地球上微生物物种的多样性及土壤的可
持续利用都具有重要意义，是当今国内外关注和研究
的热点问题之－－［ １。
定量和定性的描述土壤微生物多样性是微生物生
态学的难题之一【３１。长期以来，囿于研究方法的限制，
人们多采用常规的分离纯化培养技术来研究土壤里复
杂的微生物多样性，但是这些方法都存在着诸多不可
避免的缺陷性【４—１，只能够培养出自然界里０．１％～
１０％的微生物【６１，因此有关土壤微生物的多样性研究
进展不大。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，ＤＮＡ
指纹图谱技术被不断应用于土壤微生物多样性的检测
［７－８１，使得人们从基因遗传水平上去更深入、更广泛地
认识土壤中微生物的多样性成为可能。变性梯度凝胶
1
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析
小麦幼苗过氧化物酶同工酶
生物111班 杨明轩 1102040128
一、研究背景及目的
过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 - 1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。基于 “差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
凝胶电泳操作步骤
凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质）的方法，下面是凝胶电泳的一般操作步骤：
1.准备工作：
a.确定实验目的和所需分析的生物大分子。
b.准备所需试剂和仪器设备，并确保其处于良好工作状态。
2.准备样品：
a.根据需要提取或制备待测样品，并对其进行初步处理。
b.确定样品浓度，并进行必要的稀释或浓缩。
3.准备电泳缓冲液：
a.准备所需的缓冲液，并在适当温度（通常室温）下使其稳定。
b.调整缓冲液的pH值，并确保其适合所需分析的生物大分子。
4.准备凝胶：
a. 根据需要选择合适的凝胶类型，如聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）或琼脂糖凝胶（agarose gel）。
b.准备适当浓度的凝胶溶液，并加入所需添加剂（如硼酸盐）来稳定凝胶。
c.将凝胶溶液倒入凝胶模具，并按需插入电极。
5.运行电泳： a.将凝胶模具放入电泳槽中，确保电极完全浸入凝胶溶液中。
b. 轻轻将样品或质量标准品（Marker）加入凝胶孔中。
c.关闭电泳槽盖，并连接电源。
e.设置合适的电压和运行时间，开始电泳。
6.染色和可视化：
a.将凝胶取出，将其浸泡在染色剂中（如乙溴黄溶液或银染液）。
b.根据所需分析的生物大分子类型选择合适的染色剂，并根据说明书进行染色步骤。
c.将染色后的凝胶放置在透明的平板背景下，使用适当的照明设备进行可视化。
7.数据分析：
a.根据染色后的凝胶图像，观察样品的分离情况和带状图案，并记录相关数据。
b. 根据已知标准品（Marker）的迁移距离计算未知样品的相对迁移速率。
c.根据实验目的和分析需求，使用适当的方法对数据进行解读和分析。
8.实验记录和报告：
a.记录实验过程中的关键步骤、参数和结果。
b.撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果和结论，并进行必要的数据分析和讨论。 需要注意的是，上述步骤是一个一般性的凝胶电泳操作流程，具体的步骤和条件可能会因实验目的、样品类型和设备设置等因素而有所差异。在进行凝胶电泳实验前，最好参考相关文献和方法以获得更详细的操作步骤和技术要求。
- 1 - 凝胶电泳的作用
凝胶电泳是一种重要的分子生物学技术，主要用于分离、鉴定和纯化生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等。具体来说，凝胶电泳可用于以下几个方面：
1. DNA分离和纯化。将DNA样品通过电场作用移动到凝胶中，不同大小的DNA片段会在凝胶中形成不同的带状图案，从而实现DNA的分离和纯化。
2. RNA分离和纯化。将RNA样品通过电场作用移动到凝胶中，同样可以实现RNA的分离和纯化。
3. 蛋白质分离和纯化。将蛋白质样品通过电场作用移动到凝胶中，不同大小和电荷的蛋白质片段会在凝胶中形成不同的带状图案，从而实现蛋白质的分离和纯化。
4. DNA和RNA的检测。通过将DNA和RNA样品在凝胶中分离后，可以用染色剂或探针进行染色或杂交检测，从而确定其存在与否、大小和数量等信息。
5. 蛋白质的检测。通过将蛋白质样品在凝胶中分离后，可以用特定的抗体或酶标记法进行检测，从而确定其存在与否、大小和数量等信息。
总之，凝胶电泳作为一种常用的分子生物学技术，具有广泛的应用前景和重要的科研价值。
