微生物限度检查的影响因素探讨

微⽣物限度检查概述及⽅法

微⽣物限度检查概述及⽅法

第⼀部分药品微⽣物限度检查原理；

⼀微⽣物学基本原理

（⼀）、微⽣物的概念和类别；

所谓微⽣物（microorgamisms）是⼀群个体微⼩结构简单⾁眼不能直接看到，必须借助显微镜以及其它⼿段才能辨别微⼩⽣物。1、结构类型

按微⽣物细胞结构和组成不同可分

原核细胞型微⽣物：代表（细菌）真核细胞型微⽣物：代表（真菌）⾮细胞型微⽣物：代表（病毒）2、营养类型

根据微⽣物的不同营养要求，可分为⾃养型和异养型两类，⼜以所利⽤能源的来源不同，分为化能营养型和光能营养型。

药品中所污染的微⽣物，从营养型⾓度看，他⼤多数异养型，且以腐⽣性和兼性寄⽣性化能异养型为主，容易⽤⼈⼯培养繁殖，是药品进⾏⽆菌及限度检查的最基本原理。3、影响微⽣物⽣长繁殖的因素

1）物理因素：温度、湿度、渗逶压、辐射

2）化学因素：营养物质、酸碱度、氧、有毒物质：

其影响微⽣物⽣长的机制主要有a 使菌体蛋⽩变性或沉淀

b ⼲扰微⽣物酶系统各的影响其代谢

c 损伤微⽣物细胞膜，使内容物逸出。

3）⽣物因素。

在微⽣物之间，微⽣物与寄主动植物之间均存在着各种互相作⽤的关系，主要为寄⽣、共⽣、拮抗关系等。噬菌体与寄主菌、细菌素对某些细菌的抗菌作⽤，就是⽣物因素的具体表现。四、微⽣物代谢及其在⽣长检定中的意义

微⽣物⽣化鉴定试验，所使⽤的基本原理，就是利⽤微⽣物所物有的代谢反应，其中⼤部分波及到酶的反应1）微⽣物主要代谢内容

A、呼吸作⽤-根据微⽣物呼吸作⽤最终电⼦受体性质分为呼吸作⽤，⽆氧呼吸作⽤及发酵作⽤三种，⽆本质区别，都是物质被氧化，同时另⼀物质被还原只是物质被氧化分解程度和释放⽔平不同。

相关的⽣化鉴反应

如过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，氰化钾试验等。B、糖的分解

有关的⽣化鉴定反应

如糖（醇、苷）类发酵试验，葡萄糖的氧化/发酵试验，甲基试验，甲基红试验，VP试验C、蛋⽩质和氨基酸的分解

相关⽣化鉴定试验

如吲哚试验、明胶液化试验、硫化氢试验等。（2）、微⽣物酶

微生物限度检查法

1 范围

本标准适用于非规定灭菌制剂及其原料、辅料检查项目包括细菌数、霉菌及酵母菌数、控 制菌检查及活螨的检查。

2 依据标准

《中华人民共和国药典》

《药品微生物学检验手册》

YBB00132002药品包装用复合膜、袋通则

3 人员资质及培训

3.1 从事药品微生物检验工作的负责人应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。

3.2 检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认可以承担某一试验前，不能独立

从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验

技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别

实验人员的继续教育计划。

3.3 检验人员必须熟悉相关检验方法、程序、检测目的和结果评价。

3.4 实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评价检验人员的能

力，必要时对其进行再培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法或技术时，有必要在检

测前确认微生物检测人员的操作技能。

4 培养基

4.1 培养基的制备

4.1.1 培养基可按处方配制。也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。

4.1.2 在制备培养基时，应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。脱水培

养基应附有处方和使用说明，配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求，

不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。

4.1.3 脱水培养基或单独配方组分应在适当的条件下贮藏，如低温、干燥和避光，所有的容器

应密闭，尤其是盛放脱水培养基的容器。商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外，

还应注明有效期、贮藏条件、适用性检查试验的质控菌和用途。

4.1.4 为保证培养基质量的稳定可靠，各脱水培养基或各配方组分应准确称量，并要求有一定

的精确度。配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下，可能需要去离子水和蒸馏水。应 记录各称量物的重量和水的使用量。

微生物限度检查知识培训

1、微生物方法验证，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。

答：没有上限。但一般不会高于100%，因为加进去的菌量是一样的，如果超过100%可看成是操作上的误差。按微生物的特性，如果不超过太多，是可以接受的，但没有具体上限。（本所控制在110%以内）。

2、在微生物方法验证时，霉菌、酵母菌计数验证只用黑曲霉及白色念珠菌做方法学验证，在操作培养过程中发现：在玫瑰红钠琼脂培养生长的白色念珠菌的形态太小与营养琼脂上培养的细菌的某些形态大小相同，这样如何判断营养琼脂上生长的菌落是否是白色念珠菌？为何这两种菌落形态相似？

答：菌落形态相似不等于就是同一种菌。在验证时，营养琼脂的验证菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，如果本底菌为0，则营养琼脂上长的菌应该不是白色念珠菌。要判断是否为白色念珠菌，应进行白色念珠菌的相应鉴定方法后才能确定。任何微生物都不可能只是从菌落就可以进行判断，只能判断为疑似，然后再做一系列相应的鉴定实验后才能进行判断。

3、生孢梭菌的适宜计数用培养基？（很多验证需对生孢梭菌进行计数）

答：最简便的方法是用硫乙醇酸盐流体培养基。该培养基上层为含氧层，适宜需氧菌生长，下层为厌氧层（下层高度最好7cm以上），适宜厌氧菌生长。在培养16~18小时这个时间进行观察，计数，超过20小时,由于繁殖量大，培养基将混浊，点计不清。或者是用哥伦比亚琼脂培养基，浇注后，置厌氧罐（袋）里，再置培养箱培养，计数。

4、微生物限度检查法中所用的培养基要进行适用性检查试验，请问这些培养基还需要做无菌检查试验吗？

答：微生物限度检查，药典上没有特别说明对培养基作无菌性检查，但每次都要做阴性对照实验，阴性对照是检查整个检验系统是否被微生物污染，实际上也包括了培养基的无菌性检查。

5、微生物限度检查法中所用的培养基如：营养琼脂、EMB、Macl等培养基其分装容器需要预先灭菌吗？

微生物限度超标原因分析及预防整改措施

一、微生物限度超标原因分析

1.1生产设备

经常使用的生产设备清洗不彻底，灭菌不充分，这些都会使生产的药品受到污染。

1.2生产工序

在药品生产中，要经过配料、灌装等许多个环节，会受到各种因素的影响，容易使药品的质量发生改变。如湿度太大，易使微生物繁殖；灭菌方法不当，会使微生物限度检查受到影响。

1.3原辅料以及中药材

中药制剂多以生药材粉制备。生药材粉没有经过消毒处理，所以在对微生物限度检查过程中，常会出现不合格现象。

1.4人员

生产操作人员在药品生产过程中及微生物检验员在微生物检查过程中，如果操作不当都有可能污染药品，导致药品微生物限度检查不合格。

1.5检验方法

微生物检验方法出现了错误导致无法得出直实的结果。

1.6环境

药品生产的洁净区和药品检验的微生物限度检查室及操作台的环境监测必须符合规定，环境监测的项目包括沉降菌检测和悬浮粒子检测等，如果有一项不合格，都有可能导致微生物限度检查不合格。

二、药品微生物超标预防整改措施 2.1药品生产的洁净区和药品检验的微生物限度检查室，必须定期消毒，如采用臭氧灭菌等。洁净室每次使用完毕清洁干净，生产期间，每周臭氧消毒一次。对药品的生产设备和检验设备每月交替使用0.2%新洁尔灭溶液和75%乙醇溶液进行日常擦拭消毒。擦拭操作台和墙壁的丝光毛巾不能混用，应严格分开。

2.2控制制备时间，如提取时间、搅拌时间都不能太长，微生物限度检验时间也要控制在1h之内，以防染菌。

2.3制备含生药材粉的药品，应对生药材粉先进行灭菌处理。采用紫外线照射法或高温干燥法灭菌。

2.4微生物检验员要确保检测方法正确，使菌落计数结果真实可信。

2.5药品生产操作人员和检验人员要严格执行GMP操作规程，上岗前进行培训。

2.6检验者每次操作前的消毒处理必须彻底，不留死角，对检验所用器具根据材料的性质进行相应的灭菌。每年对干热灭菌法和湿热灭菌法所使用的设备进行验证，干热灭菌法一般用电热恒温干燥箱灭菌，采用生物指示剂枯草芽孢杆菌孢子进行验证;湿热灭菌法一般用高压蒸汽灭菌器灭菌，采用生物指示剂嗜热脂肪杆菌孢子进行验证。打开药品包装的工具，如剪刀等也应消毒，检验用的器具应清洗干净，再灭菌，吸管放液时不得接触液面，样品必须放尽。这些环节都有可能污染药品，导致实验误差，所以要根据具体情况建立科学的标准操作规程，正确熟练的掌握无菌操作。