分子生物学与体外诊断技术

・１　８・　国外医学分子生物学分册２００２年第２４卷第ｌ期　体外翻译系统在分子生物学研究中的应用　李前综述孙曼霁审阅　军事医学科学院毒物药物研究所（北京，１００８５０）　摘要体外积译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是分子生物学中一种常规的表达系统。该系统可用于蛋白　质快速分析鉴定，基因转录和积译的调控机理的研究以及分子阃的相互作用的研究，如蛋白质和蛋白质的相互作　用，蛋白质与ＤＮＡ的相互作用，蛋白质与ＲＮＡ的相互作用等。　美键词体外积译系统；基因表达谓控　体外翻译系统又称无细胞蛋白质台成系统，是　一种相对胞内表达系统而言的开放表达体系。翻译　系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的　改变，因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内　表达系统具有许多优点如内源性ｍＲＮＡ干扰很小　（由于体外翻译系统是用指定的模板进行目的蛋白　质台成，因而可以大大降低或消除在体内翻译系统　中由于内源ｍＲＮＡ所造成的背景）；可以同时加入　多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用；体外翻　译系统可以对基因产物进行特异性标记，便于在反　应混台物中检测。此外体外翻译系统是一种蛋白质　快速鉴定系统，蛋白质表达可以不需要先进行克隆。　目前，体外翻译系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取　物系统、Ｅ．∞“￥３０系统３种。　１　真核体外翻译系统在分子生物学研究中　的应用　１．１兔网织红细胞系统　体外翻译系统中兔网织红细胞系统是真核体外　翻译系统中应用最广泛的一种，常用于较大的ｍＲ—　ＮＡ种类鉴定，基因产物性质的分析，转录和翻译调　控的研究，以及共翻译加工的研究等等。兔网织红细　胞用新西兰大白兔制备　］，通过纯化除去兔网织红　细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后，提取物用　微球菌核酸酶破坏内源ｍＲＮＡ，最大限度降低翻译　背景。裂解物包含蛋白质台成所必须的细胞内组分　（ｔＲＮＡ，核糖体，氨基酸，起始、延伸、终止因子）。为　了使系统更适于ｍＲＮＡ的翻译，兔网织红细胞中还　添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，　以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制，此外还　添加了ｔＲＮＡｓ混合物用于扩大ｍＲＮＡ翻译的范　围，以及乙酸钾和乙酸镁等。兔网织红细胞具有一　定的翻译后加工活性，包括翻译产物的乙酰化，异戊　二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信号肽切除　以及蛋白质糖基化等翻译后加工事件可以通过加入　犬微粒体膜来实现口］。　１．２．１利用兔网织红细胞体外翻译系统进行蛋白质　表达鉴定兔网织红细胞体外翻译系统对外源基因　进行表达具有简单、快速的优点，常被应用于对所构　建的基因进行快速鉴定，通过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测翻译　后蛋白质分子量的大小以证实基因的读码框架是否　正确，以及基因表达的蛋白质是否存在错义突变，大　小是否完整，或通过测定表达产物的活性进行鉴　定０。“。ＰＣＲ技术结台体外转录和翻译系统可以使　基因不需要先克隆而直接进行表达口］。许多基因疾　病和肿瘤都是突变的结果，如终止密码子突变，移码　或基因片段缺失，一般都导致截断的基因产物。一般　需通过测序来鉴定是否突变，这是最可靠的检测方　法。但要对许多样品筛选，测序工作量则太大。在　ｌ　９９３年，Ｒｏｅｓｔ等发展了一种蛋白质截断试验，在体　外翻译系统中快速而简单地对这些截断的突变体进　行筛选　ｊ。　１．２．２研究影响蛋白质翻译过程和翻译后加工的因　素　利用体外翻译系统的开放特性可以在翻译前，　翻译过程中，以及翻译后添加各种蛋白质、核酸、药　物、无机离子等（如在体外翻译后加入蛋白酶，研究　产物的抗蛋白酶水解作用口］，或加入适当的离子，研　究产物的活性与离子的关系　），或是改变反应的温　度、时间等翻译过程中的影响因素，以研究表达产物　的性质咖。　翻译系统还常用于进行蛋白质的翻译后加工的　研究，如信号肽的切除和产物的糖基化加工等　。　在体外翻译体系中加入犬微粒体膜，表达产物可进　行糖基化加工，不加膜产物不被糖基化，糖基化产物　通过ＳＤＳ　ＰＡＧＥ可区别于未糖基化的蛋白质　ｌｌ＿。　

体外诊断医疗器械标准

体外诊断用检测仪器和设备标准

仪器和器具通用标准

体外诊断用检测仪器除基本性能应符合相应的标准要求外，其安全性也应满足相关安全标准要求,通用标准为GB/T18268.26、YY0648o

GB/T18268.26根据体外诊断设备的特性及其电磁环境，规定了其电磁兼容性的抗扰度和发射的基本要求。同常规医用电气设备一样,体外诊断设备也被广泛应用于各种电磁环境中，除了应在典型的医用环境（医院、诊所等）中正常工作外，也应在家庭环境中正常、安全地工作。也就是说,体外诊断设备应有与这些环境相适应的基本抗扰度等级。

YY0648是强制性国家标准GB4793.1的专用标准之一，适用于预期用作体外诊断医用目的的医用实验室仪器。基于体外诊断设备预期用途特殊性，操作人员可能接触各类具有生化危险的人体样本、化学试剂等。为保护操作人员安全,YY0648等同转化了IEC61010—2—101,为安全性标准，提示操作人员操作设备可能产生的生化危险、电气危险等，以保护操作人员防电击、防生化危险等。该标准的全部内容都与强制性国家标准GB4793.1相关。

血液学和流式细胞学检测仪器标准

血细胞分析是临床常规检验之一。血细胞分析仪集成了生物、化学、光学、流体力学、电子电路、计算机软件等多学科技术，自20世纪50年代以来，经过多年发展和技术革新，不仅能对血液中的红细胞、白细胞、血小板等有形成分进行计数和定量分析，还能对细胞群进行识别、区分和分析。同时，利用计算机强大的信号采集、分析和运算能力，更多具有临床意义的参数也被发掘出来。随着高性能计算机、高精密度和快速图像获取设备及大数据库的诞生，自动化细胞图像分析设备正在以准确度高、速度快、网络俯口人性化走进临床实验室。

流式细胞术是利用流式细胞仪对人体样本中的有形成分，包括细胞、血小板、细胞器、精子、微生物以及人工合成微球等的多种生物和物理、生化特性进行计数和定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的细胞参量分析技术。流式细胞仪是集激光、紫外光等多光源、单克隆抗体、荧光染料、标记技术、计算机及其软件为一体的高通量、多参数、细胞或颗粒分析与分选仪器。具有速度快、精度高、准确性好等特点，是一种先进的细胞定量分析技术。

２　８　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｖｏ１．３４　Ｎｏ．１　２０　１　５　

”一　Ｉ十＾　～　｝综述与专论；　●　＇　－１ｈ　■＇　●１ｈ　＇　—■＾　

梨形虫病的分子生物学诊断技术研究进展　

唐秀芬　，孙　明　，张伟　，陈泽　，　

（１．民勤县动物疫病预防控制中心，甘肃民勤７３３０００；　

２．中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，　

农业部草食动物疫病重点实验室，甘肃省动物寄生虫病重点实验室）　

摘　要：梨形虫病是一种越来越受关注的蜱播原虫病。本文着重阐述了如何应用分子生物学技术　

诊断梨形虫，并建立简便快捷的病原学检测方法。这不仅为梨形虫的流行病学调查奠定基础，而且　

为有效开展梨形虫病的防治工作提供重要依据。　

关键词：梨形虫病；分子生物学；研究进展　

［中图分类号］Ｓ　８５２．７２　３［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００４—６７０４（２０１５）０１—００２８—０４　

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　

ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｐｉｐｏｐｌａｓｍｓｉｓ　

ＴＡＮＧ　Ｘｉｕ—ｆｅｎ　，ＳＵＮ　Ｍｉｎｇ　，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｉ　，ＣＨＥＮ　Ｚｅ　，　

（１．Ｍｉｎｑｉｎ　Ｃｏｕｎｔｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｅｐｉｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｍｉｎｑｉｎ，Ｐ．Ｒ　Ｃｈｉｎａ；　２．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｒａｚｉｎｇ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ＭＯＡ，　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｕｊｉａｐｉｎｇ　１，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００４６，Ｐ．Ｒ　Ｃｈｉｎａ）　

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1 分子生物学诊断

分子生物学诊断又称基因诊断，主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和和结构进行测定。自1976年以来，基因诊断方法取得巨大进展。建立了DNA限制性内切酶图谱分析，核酸电泳图谱分析， 限制性核酸片段长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP）寡核苷酸指纹图分析（Analysis of fingerprint map），核酸序列分析，聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），核酸探针（原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交），免疫印迹又称Western印迹（Western

blot，WB）、主要用于病原微生物分类的DNA中G+C mol%含量测定技术以及新近几年发展起来的DNA芯片（DNA Chip）技术等诊断技术。具有代表性的技术主要有PCR技术、核酸探针和DNA芯片（DNA Chip）技术。

一、PCR技术

PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸底物（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）存在的条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA作为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸作为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合（退火）、引物延伸合成 DNA这三步构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板

DNA。这样，目的DNA的数量将以2n -2n的形式累积，在2h内可扩增30（n）个循环， DNA量达原来的上百万倍。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。

PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR（reverse