实验五 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定

实验日期：2011.9.28

叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定

一、实验原理

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。

1. 叶绿体色素的结构与分离

叶绿素a为蓝黑色固体，在乙醇溶液中呈蓝绿色；叶绿素b为暗绿色，其乙醇溶液呈黄绿色。Chla与Chlb是吡咯衍生物与镁的络合物，它们很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。Chla与Chlb是植物进行光合作用必需的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。通常植物中叶绿素a的含量是叶绿素b的三倍。其结构式如下：

类胡萝卜素是一种橙色的天然色素，属于四萜，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中β异构体含量最多。

RR

β-胡萝卜素(R=H)和叶黄素(R=OH)

叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体内，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在石油醚中溶解度较小。秋天，高等植物的叶绿素被破坏后，叶黄素的颜色就显示出来。

叶绿素与类胡萝卜素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

2. 叶绿体色素的物理性质

叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光亮度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它从第一单线态返回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。因为分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长。

3. 叶绿体色素的化学性质

叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。

实验报告

课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型：

实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定

姓名： 专业： 学号：

同组学生姓名： 指导老师：

实验地点： 实验日期：

一、实验目的和要求 二、实验内容和原理

三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤

五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析

七、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。

2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。

二、实验内容和原理

以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。

原理如下：

1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 装

订 2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。

COOCH3

COO-

C32H30ON4Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH

+C20H39OH

COOC20H39 COO-

3、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+,

光合和呼吸代谢

【模块实验目的】

光合作用与呼吸作用是植物代谢的两大核心内容。前者是物质合

成与能量储存的过程，属于同化作用，为包括人类在内的几乎所有生物的生存提供了物质来源和能量来源，对人类和整个生物界都具有非

常重要的意义；后者是物质分解与能量释放过程，属于异化作用，为

生命活动提供能量。光呼吸是在光下绿色细胞发生吸氧与放出二氧化碳的过程，虽然在气体交换方面它与光合作用正好处于相反方向，但

无论从发生部位、对光的依赖及在生化上的联系来看，都同光合作用

具有很密切的关系。本模块实验通过测定玉米种子萌发至两周内的呼吸速率。线粒体H+-ATP酶活性、光合速率、叶片中叶绿素含量及乙

醇酸氧化酶活性，了解研究植物的光合和呼吸代谢的基本方法。

【流程图】

培养一周

4-1 叶绿体色素的提取和分离

[实验目的] 玉米种子

幼苗

乙醇酸氧化酶活性测定 呼吸速率测定

叶绿体色素的提取和分离 光合速率测定

叶绿素a和b含量测定 叶绿体色素理化性质 线粒体H+-ATP酶活性测定 了解和掌握叶绿体色素提取、分离的原理和方法。

[实验原理]

叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包

括胡萝卜素和叶黄素）两大类。他们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙

酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂

对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度

不同，经过一定时间后，可分开各种色素。

[器材与试剂] 1.实验仪器与用具

研钵、漏斗、剪刀、滴管、圆形滤纸（直径11cm）、层析缸

2.实验试剂

丙酮、甲醇、石英砂、碳酸钙、无水硫酸钠、四氯化碳、乙醚

3.实验材料

玉米幼苗叶片

[实验步骤] 1.叶绿体色素的提取：取新鲜叶片4g，洗净，擦干，去掉中脉，

剪碎，放入研钵中，研钵中加2~3ml 95%乙醇，研磨至匀浆，再加

实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定

摘自王尊本主编,综合化学实验(第二版),第226-244页,北京:科学出版社,2007年9月。

实验三十四 植物叶绿体色素的提取、分离、 表征及含量测定[1-27]

一、叶绿体色素的提取

(一) 实 验 目 的

1)掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。

2)了解皂化-萃取提取胡萝卜素的原理。

3)了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素的原理。

(二) 实 验 原 理

植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源。在把光能转化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用。高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类,主要包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素四种。它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表34.1。

表34.1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量

项 目 叶绿素 类胡萝卜素

叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素 叶黄素

颜色 蓝绿色 黄绿色 橙黄色 黄色 在叶绿体内各色素含量比例 3 1 2 1

3 1 叶绿素chlorophylls是叶绿酸的酯,它在植物进行光合作用中吸收可见光,并将光能转变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)两种结构相似的形式存在,其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。叶绿素的基本结构见图34.1。在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环,它们由四个甲烯基联结成卟啉环,在卟啉环中央有一个镁原子,它以两个共价键和两个配位键与4个吡咯环的氮原子结合成内配盐,形成镁卟啉。在叶绿素分子中还有两个羧基,其中一个与甲醇酯化成COOCH3,另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。 类胡萝卜素carotenoids是一类不饱和的四萜类碳氢化合物(例如胡萝卜素,carotenes,或它们的氧化衍生物(例如叶黄素类,xanthophylls。所有的类胡萝卜素均源于非环状的C40H56结构。类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化;在弱光下,可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。胡萝卜素有3种异构体,即、和 胡萝卜素,其中 胡萝卜素含量最多,也最为重要。 胡萝卜素还具有维生素A的生理活性,其结构是由两分子维生素A在端链失去两分子水结合而成。在生物体内,胡萝卜素受酶催化氧化即形成维生素A。而叶黄素3,3`-二羟基-α-胡萝卜素,lutein,C40H56O2是一种常见的氧化型的类胡萝卜素。 植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定在植物生理学、农业和海洋科学研究中具有重要意义。同时,叶绿素和胡萝卜素等天然色素在食品工业和医药工业中也有广泛的用途。