叶绿体色素的提取、分离及其理化性质鉴定

实验日期：2011.9.28

叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定

一、实验原理

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。

1. 叶绿体色素的结构与分离

叶绿素a为蓝黑色固体，在乙醇溶液中呈蓝绿色；叶绿素b为暗绿色，其乙醇溶液呈黄绿色。Chla与Chlb是吡咯衍生物与镁的络合物，它们很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。Chla与Chlb是植物进行光合作用必需的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。通常植物中叶绿素a的含量是叶绿素b的三倍。其结构式如下：

类胡萝卜素是一种橙色的天然色素，属于四萜，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中β异构体含量最多。

RR

β-胡萝卜素(R=H)和叶黄素(R=OH)

叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体内，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在石油醚中溶解度较小。秋天，高等植物的叶绿素被破坏后，叶黄素的颜色就显示出来。

叶绿素与类胡萝卜素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

2. 叶绿体色素的物理性质

叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光亮度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它从第一单线态返回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。因为分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长。

3. 叶绿体色素的化学性质

叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。

实验报告

课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型：

实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定

姓名： 专业： 学号：

同组学生姓名： 指导老师：

实验地点： 实验日期：

一、实验目的和要求 二、实验内容和原理

三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤

五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析

七、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。

2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。

二、实验内容和原理

以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。

原理如下：

1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 装

订 2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。

COOCH3

COO-

C32H30ON4Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH

+C20H39OH

COOC20H39 COO-

3、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+,

实验四、叶绿素的提取、分离及化学性质鉴定

一．实验目的：

掌握植物中叶绿体色素的成分分离和定性、定量分析的原理和方法。

二．实验原理：

1、溶解性。

叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取

2、吸附性。滤纸对Chlb、Chla、叶黄素、胡萝卜素的吸附能力不同(？)，当用石油醚作推动剂时，其在滤纸上的移动速度不同，可相互分离。

当用适当溶剂推动时，混合物中各成分在两相（固定相和流动相）间具有不同分配系数，所以移动速度不同，一定时间后可将各种色素分离

三．实验材料:

新鲜植物叶片

器具：

研钵一个，漏斗一个，刻度试管两支，剪刀一把，长滴管一个，培养皿(直径9cm)一个，圆形滤纸（11cm和7cm)各一张，滤纸条一张

试剂：95%乙醇，石油醚

四．实验步骤:

1.色素提取（乙醇粗提液）

a.取新鲜叶片洗净擦干，去中脉 称1g左右 剪碎于研钵

b.研钵中加3-5ml 95%乙醇研磨成匀浆 过滤于刻度试管 残渣用少许乙醇冲洗一并过滤 定容至10ml

注：研磨用石英砂或SiO2以利于充分研磨，加入CaCO3以保护叶绿素。

2.荧光观察

将乙醇提取液试管放于太阳光下观察反射光和透射光下的颜色

现象：透射光下呈绿色，反射光下呈红色为叶绿素荧光

3.色素萃取（石油醚提取液）

取乙醇提取液5ml与另一支试管 加2ml石油醚摇荡 静止片刻上层深绿色为石油醚提取液

注：用丙酮提取会更好些，各色素在石油醚中溶解度不同

4.色素分离

a.将（11cm)圆滤纸中间剪一小圆孔 取滤纸条捻成紧实芯一端插入圆滤纸中心（孔缘与纸芯紧贴且露出少许，最好相平） 用长滴管吸少许石油醚提取液滴于纸芯上端

待风干后再滴加几次。

b.将盛有石油醚的内盖（不要过满）放于培养皿中央 将插上纸芯的滤纸放在培养皿上纸芯下端浸入石油醚 迅速盖好培养皿。

光合和呼吸代谢

【模块实验目的】

光合作用与呼吸作用是植物代谢的两大核心内容。 前者是物质合 成与能量储存的过程，属于同化作用，为包括人类在内的几乎所有生 物的生存提供了物质来源和能量来源，对人类和整个生物界都具有非 常重要的意义；后者是物质分解与能量释放过程，属于异化作用，为 生命活动提供能量。光呼吸是在光下绿色细胞发生吸氧与放出二氧化 碳的过程，虽然在气体交换方面它与光合作用正好处于相反方向，但 无论从发生部位、对光的依赖及在生化上的联系来看，都同光合作用 具有很密切的关系。本模块实验通过测定玉米种子萌发至两周内的呼 吸速率。线粒体H+-ATP酶活性、光合速率、叶片中叶绿素含量及乙 醇酸氧化酶活性，了解研究植物的光合和呼吸代谢的基本方法。

【流程图】

4-1叶绿体色素的提取和分离

［实验目的］

了解和掌握叶绿体色素提取、分离的原理和方法。 [ 实验原理 ]

叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素 a和叶绿素b）和黄色素（包 括胡萝卜素和叶黄素） 两大类。 他们与类囊体膜相结合成为色素蛋白 复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙 酮等有机溶剂提取。 提取液可用色谱分析的原理加以分离。 因吸附剂 对不同物质的吸附力不同， 当用适当的溶剂推动时， 混合物中各种成 分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度 不同，经过一定时间后，可分开各种色素。

[ 器材与试剂 ]

1. 实验仪器与用具

研钵、漏斗、剪刀、滴管、圆形滤纸（直径 11cm）、层析缸

2. 实验试剂 丙酮、甲醇、石英砂、碳酸钙、无水硫酸钠、四氯化碳、乙醚

3. 实验材料

玉米幼苗叶片

[ 实验步骤 ]

1. 叶绿体色素的提取：取新鲜叶片 4g,洗净，擦干，去掉中脉， 剪碎，放入研钵中，研钵中加 2~3ml 95%乙醇，研磨至匀浆，再加 10~15ml

95%乙醇，提取3~5min，过滤，残渣用5ml 95%乙醇冲洗， 合并滤液，定容至 25ml。