叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定

叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定

1 实验目的

（1）学习用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法；

（2）验证叶绿体素的理化性质。

2 实验原理

2.1 叶绿素的提取

叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合称为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加一分离和鉴别。

2.2 叶绿素的分离

薄层层析色谱法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上称一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。流动相通过毛细血管作用由下而上浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断地吸附、脱吸附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一点，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

2.3 叶绿素理化性质测定

叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较为稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜带叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多只植物的浸渍标本。

2.4 叶绿素含量的测定

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL

式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1 cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645 nm处。已知在波长663 nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645 nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式：

A663=82.04Ca+9.27Cb （1）

A645=16.76Ca+45.60Cb （2）

式（1） （2）A663nm和A645nm为叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度，以mg/L为单位。

解方程（1） （2）组得

Ca=12.72 A663—2.59 A645 (3)

Cb=22.88 A645—4.67 A663 (4)

将Ca+Cb相加即得叶绿素总量CT

CT ＝ Ca十Cb＝20.29A645—8.05 A663 (5)

从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素a、叶绿素 b 总量

所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算：

CT ＝5.341000652A (6)

有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler等对Arnon进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：

Ca＝12.21A663—2.59 A646 (7)

Cb=20.13 A646—5.03A663 (8)

Cx.c ＝ 22910427.31000470baCCA (9)

由于叶绿素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。绿素a 、叶绿素b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm,类胡萝卜素为470nm,可据此列出以下关系式；

Ca＝13.95A665—6.8A649 (10)

Cb=24.96 A649—7.32A665 (11)

Cx.c ＝2488.11405.21000470baCCA (12)

式中：Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度； Cx.c为类胡萝卜素的总浓度；A665 A649 A470

分别为叶绿素提取液在波长665 nm、649 nm、470 nm下的吸光度。

3 实验材料与试剂

天平、研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、点样毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸、刻度试管、小试管、试管架、水浴缸、10 ml移液管、分光光度计、电子顶载天平（感量0.01g）、棕色容量瓶、定量滤纸、吸水纸、滴管。

新鲜的绿菠菜叶、体积分数为95%的乙醇、碳酸钙粉末、展开剂、苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液。

4 实验步骤

4.1 色素提取液的准备

（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4～5片(2 g左右)，洗净，擦干，去掉中脉后剪碎，放入研钵中。

（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2～3 mL 95％乙醇，研磨至糊状，再加10～15 mL 95％乙醇，提取3～5 mins，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10 mL 95％乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。

（3）如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片(以菠菜为最好)；先用105 ℃杀青，再在80 ℃下烘干，研成粉末，密闭贮存。用时称叶粉1 g放入小烧杯中，加95％乙醇20～30 mL浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。

（4）另取一研钵，放入剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂(不加碳酸钙粉)，用水研磨。先加2 mL蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水30 mL，摇匀，使成叶绿体悬浮液。

4.2 叶绿素的分离

（1）取一层析板，在距滤层析板一端约1 cm处用铅笔画一条细的横线。

（2）画滤液细线，用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀地画出一条细而直的滤液细线。

待滤液风干后，再画5~6次。

（3）分离叶绿体中的色素，将3 mL层析液（丙酮）倒入烧杯中，将层析板（有滤液细线的一端朝下）略微料靠着烧杯的内壁，轻轻地插入到层析液中，随后用培养皿盖盖上烧杯。注意，不能让滤纸上的滤液细线触到层析液。

（4）观察实验结果，待层析液运动到层析板顶端约0.5 cm处时，取出层析板，观察层析板上的色素带颜色、位置、宽窄，并且填写实验报告。

（5）计算各色素带的Rf值，确定各色素名称。

4.3 叶绿体色素理化性质测定

用本实验第一项中提取的叶绿体色素乙醇溶液和叶绿体悬浮液，进行以下实验。

（1）光对叶绿素的破坏作用

a. 取4支小试管，其中2支各加入5 mL叶绿体悬浮液，另外2支各加入2.5 mL叶绿体色素乙醇提取液，并用95％乙醇稀释1倍。

b. 取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片匀浆的试管，放在直射光下，另外2支放到暗处，40 Min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。

（2）荧光现象的观察取1支20 mL刻度试管加入5 mL浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同，解释原因。

（3）皂化作用(绿色素与黄色素的分离)

a. 在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5 mL 20％KOH—甲醇溶液，充分摇匀。

b. 片刻后，加入5 mL苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～1.5 mL蒸馏水，轻轻混匀(勿激烈摇荡)，于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层：下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素A和B(以及少量的叶黄素)；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。

（4）吸收光谱的观察将上述已分层的试管溶液，用分光镜观察两类色素的吸收光谱，首先让下层绿色素部分对准进光孔，看光谱有何变化；然后再将上层的黄色素溶液对准进光孔，看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。

（5）H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用

a. 取2支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2 mL，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5 mL，再加入5％ HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。

b. 当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。

c. 另取醋酸—醋酸铜溶液20 mL，以烧杯盛之。取新鲜植物叶片2片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。

4.4 叶绿素含量的测定

（1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

（2）称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3 ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10 ml，继续研磨至组织变白。静置3～5 min。

（3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25 ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。