基于ERIC-PCR指纹图谱技术的小鼠肠道菌群失调分析方法的建立

动物营养学报2010,22(4):9852991Chinese J ournal of Animal Nutritiondoi :10.3969/j.issn.10062267x.2010.04.026利用ERIC 2PCR 和PCR 2D GGE 技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性潘康成　陈正礼　崔恒敏3　冯　兴　盛　琴　赵　爽(四川农业大学动物医学院,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安625014)摘　要:本文旨在采用ERIC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性。

选用15羽28日龄肉鸡,按2mL /kg B W 喂服枯草芽孢杆菌悬液(109C FU/mL ),每天2次,连续3d ,34日龄时,利用ER IC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法分析肠道菌群的多样性,并对D G G E 条带进行回收、测序。

结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P <0105或P <0101),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为5312%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PC R 2D G G E 明显优于ERIC 2PC R ;回收条带以乳杆菌属细菌为主。

结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PC R 2D G G E 检测方法明显优于ERIC 2PC R 。

关键词:枯草芽孢杆菌;肉鸡;肠道菌群;多样性;ERIC 2PC R ;PC R 2D G G E中图分类号:S831 文献标识码:A 文章编号:10062267X (2010)0420985207收稿日期:2010-01-14基金项目:“教育部长江学者和创新团队发展计划”创新团队资助项目(I R T0848)作者简介:潘康成(1971-),男,苗族,贵州榕江人,副教授,博士,主要从事动物微生态学和发酵工程研究。

ERIC–PCR技术在肠球菌基因分型的应用包万华（动医06-2班，动物科技学院，指导老师：齐亚银）摘要：【目的】建立肠球菌ERIC- PCR分子生物学分型技术,并应用于临床分离菌株的流行病学调查。

【方法】以肠杆菌科基因间重复序(Enterbacterialrepetitive intergenic consensus ,ERIC) 为引物,对临床分离的肠球菌菌DNA 进行PCR 扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后得到指纹图并进行分析。

【结果】24 株临床分离株产生3 种不同的指纹图,密切接触者指纹图相同或相似,指纹图谱与患者年龄有关。

【结论】ERIC- PCR是肠球菌流行病学调查的有效技术。

关键词: 肠球菌 ERIC–PCR 基因分型Abstract：【Objective】To establish the ERIC-PCR DNA fingerprinting technique for typing ntestinal bacteria and apply it in the epidemiological investigation．【Methods】PCR was performed with the primers ERIC and DNA fingerprinting were analyzed by software．【Results】A total of 3 different fingerprints were detected．The characteristics of ERIC-PCR Fingerprint patterns were related to age, drug resistance and type of resistance. 【Conclusion】ERIC-PCR DNA fingerpriming technique developed in this study is effective way for molecular epidemiological investigation of ntestinal bacteria．Key words：Intestinal bacteria; ERIC-PCR; Genotyping肠道致病菌对人类健康危害很大,可导致各种疾病的发生,因而越来越引起重视并成为研究热点。

基于PCR-DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立张素珍;李思施;韦婷婷;张凯;关家伟;吴大畅【摘要】通过比较4种小鼠粪便细菌总DNA提取方法对基于PCR-DGGE检测的肠道菌群多样性分析的影响,旨在建立适于PCR-DGGE的小鼠肠道微生物宏基因组提取的稳定、经济、快捷的方法.采用SDS裂解法、某国产市售粪便DNA提取试剂盒、改进的化学裂解法、改进的溶菌酶法4种方法提取小鼠粪便细菌总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、细菌16S rRNA V3区PCR扩增结合DGGE对提取结果进行比较分析.SDS裂解法和国产市售试剂盒2种方法提取粪便细菌总DNA均未得到理想结果,另2种方法均能够检测到粪便中20种左右的细菌.改进的化学裂解法和改进的溶菌酶提取法的建立为基于PCR-DGGE进行肠道菌群结构的定量及定性分析提供了可靠的前提基础和实验保障.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2013(033)005【总页数】5页(P32-36)【关键词】肠道菌群;小鼠粪便;DNA提取;PCR-DGGE【作者】张素珍;李思施;韦婷婷;张凯;关家伟;吴大畅【作者单位】大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044【正文语种】中文【中图分类】Q93-336哺乳动物肠道内细菌组成非常复杂。

近年来，肠道菌群对机体健康和疾病的影响越来越受到人们的关注［1-2］，粪便与肠道内容物相似，含有大量的微生物、未消化食物和肠道脱落细胞等［3］，粪便微生物的变化可以间接地反映肠道微生物的变化。

粪便分析技术不同于采血或取组织获取样本，属于非损伤性取样，应用性强［4］。

在肠道菌群数量和种类鉴定过程中，因厌氧菌占多数，难以利用传统的选择培养法进行培养，因此无法对其深入研究［5］。

ERIC-PCR简介1 肠杆菌基因间重复共有序列(ERIC)的发现与分布1990年,Sharples等在对Escherichia coli tls基因组中ds的3′末端区进行分析时首次发现了ERIC片段,命名为“基因间重复单位”[IRU (Intergenic Repetitive Unit)]序列。

随后,Hulton等也鉴定出了相同的重复序列,并命名为ERIC(En-terobacterial Repetitive Intergenic Consensus),即肠杆菌基因间保守重复序列。

并且在其他的肠道细菌基因组中也发现了相似的序列。

曹又方等对46个已测序的菌株进行全基因组序列搜索,结果表明ERIC仅主要存在于肠道细菌基因组间,并且含有该序列的细菌基因组中,序列的重复频率差异也很大。

目前尚未在细菌噬菌体和质粒上发现有ERIC序列的存在。

2 ERIC结构特征及功能ERIC序列长约126 bp,定位于基因组中可转录的非编码区域与转录有关的区域内,但与编码序列没有特定的关系,其中包含几个反向重复序列。

在基因组中ERIC 可以完整或部分缺失的状态存在,位于多顺反子操纵子基因间区域,或位于阅读框内上、下游不翻译区域,唯一已知例外是Vibro cholerae基因组中,有一个ERIC序列包含在sul 基因5′末端ERIC的功能目前还不太清楚,只是根据它的结构作了一些猜测。

认为位于基因其茎环结构防止外切核酸酶对基因3′末端的ERIC可能由于形成二级结构后, 3′末端的降解,促进上游基因的表达;ERIC在基因组间的位置和拷贝数具有种属特异性,可能该序列本身就为DNA提供某些结构或功能相关的信息,这些信息从而影响核酸的代谢,或者提供位点用于在类被核酸代谢相关的特定蛋白识别,核中组织染色体;大多数ERIC是可以转录的,在mRNA中的茎环结构可能干扰核糖体与之结合进而影响翻译的进行;ERIC可能通过促进基因的重新排列或者为基因重组提供不稳定位点来影响整个基因组的稳定性。

ERIC-PCR简介
：Versalovic于1996年描述的一种细菌基因组指纹分析方法，即细菌基因组重复序列PCR技术（rep-PCR）是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。

细菌基因组中广泛分布的短重复序列（repetitivesequence），包括常用的REP （repetitiveExtragenicPalindromic,基因外重复回文系列）、ERIC（肠杆菌基因间重复一致序列）和BOX，它们在菌株、种、属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。

Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类，此方法操作方便，可以大样本进行。

REP-PCR分辨效果好，可重复性强，比RFLP、生化分型，核糖体分型要好。

REP-PCR目前可自动化分型，并可建立各种细菌REP、ERIC-PCR分型标准数据库。

腹泻患者肠道菌群数量变化及ERIC—PCR指纹图谱分析目的了解粪检有白细胞的腹泻患者与健康者肠道菌群变化及指纹图谱差异。

方法提取解放军第252医院临床门诊30名健康成人和30例腹泻成人的粪便总DNA为模板，分为对照组和腹泻组。

荧光定量法测定肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌、肠球菌的菌群数量，ERIC-PCR指纹图谱法检查各组肠道菌群组成多样性差异。

结果两组肠道菌群数量：对照组粪便中双歧杆菌为（8.85±0.57）拷贝/g，乳酸杆菌为（8.36±0.45）拷贝/g；腹泻组粪便中双歧杆菌为（8.28±0.68）拷贝/g，乳酸杆菌为（7.79±0.39）拷贝/g；与对照组比较，腹泻组中该两种细菌数量明显减少（P 0.05）。

腹泻患者肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱条带明显减少。

结论腹泻患者的肠道菌群结构发生了改变，菌群数量明显减少。

[Abstract] Objective To analyze the diversity variation and the fingerprints difference of intestinal microflora between diarrhea patients with the fecal leukocytes and health people. Methods 30 cases of normal people and 30 cases of diarrhea patients in No.252 Hospital of PLA were selected，whose total fecal DNA were used as model，were divided into control group and diarrhea group. Intestinal Bifidobacterium，Lactobacillus，Escherichia Coli，Enterococci bacteria number were detected by quantitative fluorescence method，the difference of intestinal flora diversity in the two groups was detected by ERIC-PCR fingerprint method. Results The quantities of intestinal microflora in the control group and diarrhea group：Bifidobacterium spp.[（8.85±0.57）copies/g vs （8.28±0.68）copies/g]；Lactobacillus spp.[（8.36±0.45）copies/g vs （7.79±0.39）copies/g]，there were significant differences （P 0.05）. The bands of ERIC-PCR fingerprints in diarrhea group were obviously declined. Conclusion The constitution of the intestinal microflora is changed in diarrhea patients and the quantity of intestinal flora is significant declined.[Key words] Diarrhea；Fluorescent quantification real-time PCR；ERIC-PCR；Intestinal flora腹泻是一种常见病，引起腹泻的原因有多种，大致可分为感染性腹泻和非感染性腹泻，其中感染型腹泻占比较高。

［7］［8］［9］［10］［11］［12］［13］［14］［15］［16］［17］［18］［19］［20］［21］［22］［23］［24］［25］［26］［27］IWAHANA H ，YOSHI MOTO K ，MIZUSAWA N ，et al ．Multi -ple fluorescence -based PCR -SSCP analysis ［J ］.Biotech -niques ，1994，16（2）：296，300．SOMMER S S ，YAN J ，LI W ，et al ．Candidate gene analyses by scanning or brute force fluorescent sequencing ，a comparison of DOVAM-S with gel-based and capillary-based sequenc -ing ［J ］.Genet Test ，2007，11（3）：235-240．MARUYA E ，SAJI H ，YOKOYAMA S ．PCR-LIS-SSCP （Low ionic strength single -stranded conformation polymorphism ）--a simple method for high-resolution allele typing of HLA-DRB1，-DQB1，and-DPB1［J ］.Genome Res ，1996，6（1）：51-57．BRINKMANN N ，MARTENS R ，TEBBE C C ，et al ．Origin and diversity of metabolically active gut bacteria from labora -tory-bred larvae of Manduca sexta ［J ］.Appl Environ Microbi -ol ，2008，74（23）：7189-7196．SUNNUCKS P ，WILSON A C C ，BEHEREGARAY L B ，et al ．SSCP is not so difficult ：the application and utility of sin -gle-stranded conformation polymorphism in evolutionary bi -ology and molecular ecology ［J ］.Molecular Ecology ，2000，9：1699-1710．李玉梅，姚纪元，吴静，等．PCR-SSCP 技术的研究及应用进展［J ］.生物技术通报，2007（6）：71-74.方美英，姜志华，刘红林，等．应用PCR-SSCPs 、PCR-RFLPs 技术检测猪氟烷基因［J ］.养猪，1997（1）：29．丁家桐，姜勋平，朱猛进，等．母猪FSH β基因对仔猪哺乳期生长影响的研究［J ］.扬州大学学报：自然科学版，1999，2（4）：38-40．李绍华，李爱云，熊远著，等．猪MSTN 基因多态性及其SNPs 的研究［J ］.遗传学报，2002，29（4）：326-331．李婧，杨润清，孟和，等．ESR 与PRLR 基因对民猪产仔数的影响［J ］.黑龙江畜牧兽医，2003（4）：11-17．陈桂芳，谢庄，强巴央宗，等．西藏牦牛、荷斯坦牛三个功能基因部分序列多态性的比较研究［J ］.畜牧兽医学报，2003，34（2）：128-131．王启贵，李宁，邓学梅，等．鸡细胞外脂肪酸结合蛋白基因单核苷酸多态性与腹脂性状的相关研究［J ］.中国科学C 辑：生命科学，2001，31（3）：266-270．王岩，沈锡权，吴祖芳，等．PCR-SSCP 技术在微生物群落多态性分析中的应用进展［J ］.生物技术，2009，19（3）：84-87．任南琪，赵阳国，王爱杰，等．PCR-SSCP 技术分析碱度影响下硫酸盐还原反应器中微生物群落动态［J ］.中国科学C 辑：生命科学，2006，36（1）：51-58．CALLON C ，DELB 魬S C ，DUTHOIT F ，et al ．Application ofSSCP -PCR fingerprinting to profile the yeast community in raw milk Salers cheeses ［J ］.Systematic and Applied Microbi -ology ，2006，29（2）：172-180．OPELT K ，CHOBOT V ，HADACEK F ，et al ．Investigations of the structure and function of bacterial communities associ -ated with Sphagnum mosses ［J ］.Environmental Microbiology ，2007，9（11）：2795-2809．SHINTANI S ，NAKAHARA Y ，MIHARA M ，et al ．Inactivation of the p 14ARF ，p 15INK4B and p 16INK4A genes is a frequent event in human oral squamous cell carcinomas ［J ］.Oral Oncology ，2001，37（6）：498-504．丁建松，曹毅，童建．PCR-SSCP 研究进展［J ］.辐射防护通讯，2004，24（5）：27-31．USHIJIMA T ，HOSOYA Y ，SUZUKI T ，et al ．A rapid methodfor detection of mutations in the lacⅠgene using PCR-single strand conformation polymorphism analysis ：demonstration of its high sensitivity ［J ］.Mutat Res ，1995，334（2）：283-292．李鸿浩，任有蛇，岳文斌．PCR-SSCP 研究进展及其在羊经济性状研究中的应用［J ］.草食家畜，2006（1）：20-22．陈强，陈云贵，王根林．HSP 70基因PCR-SSCP 实验条件的优化［J ］.畜牧与兽医，2008，40（2）：66-67．□ERIC-PCR 的研究进展刘博婷（韶关学院生物科学系，广东韶关512005）摘要：肠道细菌基因间重复序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC ）是主要存在于肠道细菌的一类基因间重复序列。