色谱法导论

18
4.温控系统
作用对象：气化室、柱箱、检测器 控温方式：恒温和程序升温
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5.检测系统
作用：将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分 的信息转变为便于纪录的电信号，然后对被分 离物质的组成和含量进行鉴定和测量。
常用的检测器： 氢火焰离子化检测器 热导池检测器 电子捕获检测器(ECD 质谱检测器
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3.分离系统
17
色谱柱：U型或螺旋型金属管（内径2～6mm，长1～ 3m）、 固定液、 载体（担体）组成。
包括：填充柱和毛细管柱
填充柱：多为U形或螺旋形；内填固定相。 毛细管柱：分为涂壁、多孔层和涂载体开管柱，内径 0.1 ～ 0.5mm，长达几十至100m，通常弯成直径 10 ～ 30cm的螺旋状；其特点为渗透性好、传质快， 分离效率高（n可达106）、分析速度快、样品量小。
记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱 流出曲线。
24
1. 基线 ➢ 在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的
曲线叫基线。 ➢ 稳定情况下是一条直线 ➢ 基线上下波动称为噪音
25
2. 色谱峰的高度（峰高，h ）
➢ 色谱峰最高点与基线之间的距离 ➢ 峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越
好
h
3. 色谱峰的宽度(区域宽度)
根据色谱图可得到的重要信息：
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（1）色谱峰个数
—判断样品中所含组分的最少个数
（2）色谱峰的位置即保留值
—进行定性分析
（3）色谱峰的h 、A
—进行定量分析
（4）色谱峰的位置及峰的宽度 —可评价色谱柱效（分离效能）
（5）色谱峰两峰间的距离 —可评价固定相或流动相选择是否合适
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四、气相色谱的应用

k = 组分在固定相中的质量 / 组分在流动相
中的质量= ms / mm
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k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱
的容量大，因此又称分配容量或容量因子。
它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。 k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱 温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的 体积有关。
tM R tR
R若用质量分数表示，即
mm R mm m s 1 1 ms 1 k 1 mm
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整理公式，可得
t R t M (1 k )
t R t M t R VR k tM t M VM
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1.3 分配系数K与容量因子 k 的关系
K=k.
其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱柱型特
亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。
2.3 按操作形式分类

固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱法。 固定相呈平板状的色谱，称为平面色谱法， 它又可分为薄层色谱法和纸色谱法。
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§2 色谱流出曲线及有关概念
1. 色谱分离过程
该过程主要利用试样中各组分在固定相和流动 相间具有不同的溶解和解析能力；或不同的吸 附和脱附能力；或其它亲和性能的差异。
分离植物色素时采用。
4
将植物绿叶的石油醚 提取液倒入装有碳酸 钙粉末的玻璃管中， 并用石油醚自上而下 淋洗，由于不同的色 素在碳酸钙颗粒表面 的吸附力不同，随着 淋洗的进行，不同色 素向下移动的速度不 同，形成一圈圈不同 颜色的色带，使各色 素成分得到了分离。
这种分离方法被命名为色谱法（chromatography）。
中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引
起区域扩宽的各种因素。

死体积本意是指色谱柱中未被固定相占据的空隙体积，也即色谱柱内流 动相的体积。但在实际测量时，它包括了柱外死体积（色谱仪中的管路 和连接头间的空间以及进样系统和检测器的空间）。当柱外体积很小时， 可以忽略不计。
6、调整保留体积 VR 保留体积减去死体积，即组分停留在固定相时所消耗的流动相体积。
VR VM t VR R F c
一、基线 二、峰高
当没有待测组分进入检测器时，在实验操作条件下， 反映检测器噪声随时间变化的曲线称为基线。稳定的基线 它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。 是一条直线。 噪音：使基线发生细小的波动的现象。 从色谱峰顶点到基线的距离叫峰高。
三、区域宽度 (峰底宽度 半峰宽 标准偏差)
色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡 量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越 窄，其效率越高，分离的效果也越好。
VR Fc t R
式中Fc为流动相平均体积流速，因为液体可以认为是不可压缩的， Fc 所以在液相色谱中， 即为实测值；而在气相色谱中，由于气体可以 压缩，必须根据色谱柱的工作状态，对实验值进行校正。 5、死体积 VM 不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积，可由死时间确定：
VM Fc t M
概述
美 国 气 相 色 谱 仪 HP高压液相色谱仪
国产气相色谱仪
一、色谱法（chromatography ）
俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置： 色谱法是一种分离技术。 试样混合物的分离过程是试样中各组分在色谱分离 柱中的两相间不断进行着的分配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流 体（气体或液体），称为流动相。 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会 与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上 的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差 异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固 定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序 从固定相中流出。

质通过不同的色谱柱,分别计算出n有效进行比较.
t R t M (1 k ' )
n有效
k' 2 n( ) ' 1 k
tR 2 tR 2 n 16 ( ) 5.54 ( ) Wb ' W1/ 2 ' tR 2 tR 2 n有效 16 ( ) 5.54 ( ) Wb W1/ 2
i/s
。
在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，
将它们的相对保留值作业重要参数，称选择因子，用符号表示，
即

t t
' R2 ' R1
式中tR (2)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。 可作为衡量固定相选择性的指标。 越大，越容易分离。=1，分离不能实现。
Vs K p csVs k' K q cmVm Vm
（一） 基线
当没有待测组分进入检测器时,在实验操作条件下， 反映检测器噪声随时间变化的曲线称为基线，稳定的基 线应该是一条水平直线。
（二）峰高
色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。
（三）区域宽度
用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。
表示色谱峰区域宽度通常有三种方法:
1)标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。

' t R2 ' t R1
k K2 k K1
' 2 ' 1
(k
'
t
' R2
tM
)
α是两个组分平衡常数或容量因子之比，是两组分在色 谱体系中平衡分配差异的量度，是热力学参数。它是柱温、 组分的性质、固定相和流动相的性质的函数。而与其它实验 条件，如柱径、柱长、填充情况及流动相流速等无关。是广 泛使用的定性数据。

W1 2 2 2 ln 2 2.355
3. 峰底宽度(基线宽度)
W b = 4σ
色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的 函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素．
(四) 保留值 1. 时间表示的保留值
①死时间 t M
②保留时间 t R
③调整保留时间 t
′ R
1）、 死时间t0或tM：不被固定相吸附或溶解的组分 流经色谱柱所需的时间。从进样开始到柱后出现 峰最大值所需的时间。 气相色谱—惰性气体（空气、甲烷等）流出 色谱柱所需的时间。 tM
吸附能力不同进行分离。
（3）离子交换色谱： 利用不同组分对离子交换剂
亲和力不同进行分离。
（4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同
的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。
3．按操作形式分类：
柱色谱
填充柱色谱 毛细管柱色谱
平面色谱
纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱
（1）柱色谱：
填充柱色谱—固定相填充到柱管内。
色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，
组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，
两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定 的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰 间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此 重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分
在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过
t V
R R 2 2 2.1 t V R R 1 1
选择因子α
在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准 （s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留 值．此时，ri,s可能大于1，也可能小于1．在多元混 合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它 们的相对保留值作为重要参数．在这种特殊情况下， 可用符号α表示： tR 2 tR 1

可以通过改变固定相、流动相、柱温或改 变相比使k发生变化。
§15-6 气相色谱定量分析
一、 峰面积的测量
1. 峰高乘半峰宽法 A = h Y1/2
峰形对称，且不太窄 2. 峰高乘平均峰宽法： A = h (Y0.15 + Y0.85 ) / 2
A = 1.065 hY1/2 不对称峰
3. 峰高表示峰面积法：

§13-3 色谱法基本理论
一、分配系数和分配比
1. 分配系数K 在一定温度和压力下，组分在两相间分配达
到平衡时的浓度比，称为分配系数。
K cS cM
一定温度和压力下，K越大，出峰越慢 试样中的各组分K值不同是分离的基础
2. 分配比 k
在一定温度和压力下，组分在两相间分 配达到平衡时，分配在固定相和流动相中的 总量之比。
峰形狭窄时，峰高定量法比面积 定量法更准确
4. 自动积分和微机处理法： 自动处理数据，报出分析结果
二、 定量校正因子
1.绝对校正因子
mi fi Ai
fi

mi Ai
物理意义：单位面积对应的物质量
fi与仪器灵敏度及操作条件有关，不易准确 测定，也无法直接应用
2.相对校正因子
气固色谱分离原理:
固定相是多孔性的固体吸附剂颗粒， 其分离是基于固体吸附剂对试样中各组 分的吸附能力的不同；
气液色谱分离原理
固定相由担体和固定液所组成，固定液 涂敷在担体表面，其分离混合物是基于固定 液对试样中各组分的溶解能力的不同。
二、塔板理论
1941年 James和Martin 数学模型 分馏塔 理论塔板数n 理论塔板高度H
色谱峰高一半处的宽度
3.峰底宽（Y）
Y ＝ 4

Kf
2 dp

T
色谱柱的渗透率与 柱阻抗因子都是柱 填料粒径的函数
5、柱压降（p）与流动相线流速（u）的影响因素
p
uL
d
2 p
4 FcL 2 d c K f
u
2 dp p
L
§18-3 溶质分布谱带展宽 ——谱动力学基础理论
一、色谱分离的条件
1、两组分的分配系数必须有差异（能分离的前提条件） K1 K2 产生速差迁移
同的组分所产生的阻碍作用不同 而进行分离的色谱法
（5) 亲和色谱 ——利用亲和固定相与分子之间特异
性亲和反应进行分离的色谱法
二、色谱法的分类
4、按色谱动力学过程分类
（1）迎头色谱——以试样混合物为流动相的色谱
（2）顶替色谱——流动相与固定相的相互作用能力大于
其与被分析组分相互作用力的色谱
（3）洗脱色谱 ——流动相与固定相的相互作用力小于其
L u
五、色谱图中的有关术语
——保留值（保留时间）
——色谱定性参数之一 ② 保留时间（tR） 进样开始到柱后出现该组分最大值时所需的时间
L tR ux
操作条件不变 时，特定组分 的tR为定值
③调整保留时间（tR´） ——色谱定性参数之二 扣除了死时间的保留时间
tR′＝ tR - tM
是组分在固定相中停留的总时间
被测物x的保留指数为：
lg t lg ( x,n) R ( x ) lg t R ( n ) I x 100X 100 [n 100 [n ] lg t lg ( n1,n) R ( n 1) lg t R ( n )
利用上式求出未知物的保留指数与文献值对照

k mS mM
k 值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的
容量大，因此又称分配容量。 它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。
k 值也取决于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、
柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。
23
3、分配系数和分配比之间的关系
k cSVS cMVM
17
§15-2 色谱分离原理
一、分离原理 气相色谱分离过程是在色谱柱内完成的，气固色谱和
气液色谱，两者的分离机理不同。 气固色谱的固定相： 多孔性的固体吸附剂颗粒，其分离是基于固体吸附剂
对试样中各组分的吸附能力的不同。 气液色谱的固定相： 由担体和固定液所组成，其分离是基于固定液对试样
中各组分的溶解能力的不同。
图15-1色谱原型
1
1906年， Tsweet 发现色谱分离现象
碳酸钙 （固定相）
色石素油混醚合液 (流动相） 色谱柱
色带
2
植物色素分离图示
3
Chromatography
Tswett将这种方法命名为色谱 法（Chromatography），很显然 色谱法 （Chromatography）这个 词是由希腊语中“色”的写法 （chroma）和“书写”(graphein) 这两个词根组成的。
2）死时间( tM )： 不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。
因为这种物质不被固定相吸附 或溶解，故其流动速度将与流动相 的流动速度相近。
测定流动相平均线速度u0时， 可用柱长 L 与 tM 的比值计算。
uu0 L tM
29
3）调整保留时间( tR ' )：
tR' = tR － tM
30

色谱法的应用领域
01
02
03
04
化学分析
色谱法广泛应用于化学分析领 域，用于分离和测定复杂有机 化合物、无机离子和金属配合 物等。
生物医药
在生物医药领域，色谱法用于 分离和纯化生物分子、药物成 分以及检测药物残留等。
环境监测
在环境监测领域，色谱法用于 检测空气、水和土壤中的有害 物质，如有机污染物、重金属 等。
新型硅胶基质固定相
硅胶基质固定相具有良好的热稳定性和化学稳定性， 可用于分离各种极性化合物。
新型聚合物固定相
聚合物固定相具有高选择性、高柱效和良好的耐受性， 可用于分离复杂样品。
新型手性固定相
手性固定相可用于拆分光学异构体，为手性化合物的 分离提供了新的解决方案。
色谱仪器的发展
高效液相色谱仪
高效液相色谱仪具有高分离效能、高灵敏度和广 泛应用的特点，已成为色谱分析的重要手段。
食品成分分析
色谱法用于分析食品中的营养成分，如脂肪、蛋白 质、糖类等，以评估食品的质量和营养价值。
食品添加剂检测
色谱法用于检测食品中添加剂的含量，确保食品的 安全性和合规性。
食品污染物检测
色谱法用于检测食品中的污染物，如农药残留、重 金属等，保障食品安全和消费者健康。
在环境监测中的应用
01
空气污染物的分离 与测定
食品工业
在食品工业中，色谱法用于检 测食品中的添加剂、农药残留 和营养成分等。
02
色谱法的基本原理
分离原理
分离原理
色谱法通过流动相和固定相之 间的相互作用，使不同组分在 固定相和流动相之间的分配系 数不同，从而实现各组分的分 离。
分配系数
各组分在固定相和流动相之间 的分配系数决定了它们在色谱 分离中的行为。分配系数越大 ，组分在固定相上的保留越强 ，越难以被洗脱。

（1）峰高（h） 组分从柱后流出最大浓度时检测器输出的信号 值(AB′)
→☆←
（2）峰宽 ①半峰宽 峰高一半处对应的峰宽(GH) ②峰底宽度（简称小平宽） 色谱峰两拐点上的切线在基础上截距间的距离。 (ZJ) ③标准偏差σ 峰高0.607倍处色谱峰宽的一半(1/2EF) σ表示组分流出的分散程度， σ越大（峰越宽） 组分流出越分散，柱数越低
2 1
1 M流动相
B/u:与流速成反比，与流动相分子的 质量成反比。因此，增加流速和采用大分 子量的流动相，选用小颗粒固定相可减小 B/u而减小H，提高柱效。另外，用短柱和 较低的柱温，也可减小B/u 由于分子在气相中的扩散系数（D气） 比在液相中的扩散系数（D液）大得多。 D气=105D液 因此液相色谱中，纵向分子扩散一般可 忽略。 →☆←
（2）液液分配色谱
C=Cm+Cs (Cm：流动相传质阻力系数；Cs：固定相传质阻 力系数；Cm：包括流动相中的传质阻力和滞留的流 动相中的传质阻力)
Cm
2 Wm d p
Dm

2 Wsm d p
Dm
（Wm：柱和填充物性质决定的因子；Wsm：与颗粒 孔中被流动相占据的分数及容量因子k有关的常数） （固定相粒度越小，孔径越大，Wsm越小。） →☆←
2 0.01k 2 d p Cg (1 k ) 2 Dg
（k:容量因子dp ; 填充物粒质Dg；组分在气相中 的扩散系数） 可见，减小填充物颗粒可减小Cg，增加Dg可减小 Cg，Dg与流动相分子量成正比，因此，减小流动相分 子量可减小Cg。 b 液相传质阻力系数：组分从固定液表面移动到液 相内部发生质量交换，达到平衡，又返回到固定液表 面的传质阻系数。 （d：固定相液膜厚度，D：组分在液相中的扩散系数）

色谱分离过程的两大特点： 第一、不同组分在通过色谱柱时移动的速度不等（差速迁 移），它提供了实现分离的可能性。 第二、各组分分子沿柱子进行扩散分布，即分子分布离散。 色谱基本理论是从微观分子运动和宏观分布平衡探讨提高分 离迁移和降低离散迁移。 色谱基本理论是从热力学和动力学两方面讨论色谱分离问题。
9
伸舌峰： 当As小于1时，色谱峰是前半部分信号增加慢，
后半部分信号减小快。因为伸舌峰主要是固定相不能给 溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过 了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。
17
色谱流出曲线的意义
色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
★应用范围广
(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物 等方面得到了广泛的应用。 (3)色谱分离是一种有效的提纯物质技术，用于制备分离，得到高纯样品。 (4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。
8
色谱分离原理
色谱分离是基于样品中各组分在两相间平衡分配的差异。
（一）保留值的定义
1、保留时间 t R（retention time）
2、死时间 tM（dead time）
3、调整保留时间 t R（adjusted retention time）
4、保留体积 VR
5、死体积 VM
6、调整保留体积 VR
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1、保留时间 t R 2、死时间 t M
从进样开始到色谱峰最大值出现时所需要的时间，称为保留时间。

色谱图上的信息： 1. 说明样品是否是单一纯化合物。 2. 说明色谱柱效和分离情况。 3. 提供各组分保留时间等色谱定性资料和数据。 4. 给出各组分色谱峰高、峰面积等定量依据或按不同 定量方法计算出的定量数据。 术语： 基线、色谱峰高、色谱峰区域宽度、标准差σ 、半峰 高宽度、色谱峰底宽、色谱峰面积。
2. 线速度：以u表示，定义为单位时间内流动相流经色 谱柱的长度，也可称为速率，单位是cm·min-1、 mm·min-1或mm·s-1。
u

L tM
18.2.6. 色谱图
色谱柱内分离的样品各组分依次进入柱后检测器 产生检测信号，其响应信号大小对时间或流动相流出 体积的关系曲线称为色谱图。
18.2.6. 色谱图
二是色谱柱结构特性参数：色谱柱的总孔隙度、渗透 性等，这直接关系到色谱仪器操作的流动相柱前压、 分析速度等。
18.2.8.色谱柱结构特性参数
18.2.8.1.色谱柱总孔隙度
柱横截面上流动相所占的分数，即色谱柱内流动相 体积与柱总体积之比：
T
Vi VP VC
VM VC
FCtM 4FC
2
M
/VR
当V = VR = nmax△Vm，洗出色谱峰，此时溶质最大浓度 Cmax,其流动相体积为VR，即为溶质保留体积：
1
Cmax


N
2
2
M
/VR
C


Cmaxe
N 2

VR V VR
2
C


Cmaxe
N 2

tR t tR
2
18.3.2.4.理论塔板的计算公式
4 dC 2 L dC 2u

(B)
(A)
2
2
Rs
tRB W1
tRA W1
(B)
( A)
2
2
Rs<1，两峰部分重叠 Rs=1，两峰刚好分离 Rs>1.5，两峰完全分离
分离度公式
Rs
n( kB' 4 1kB'
)(1)
n16Rs2(1)2(1kB k'B' )2
1、n理论塔板数，n越大，Rs越大——n=L/H，降低塔板 高度H来增加塔板数
速率理论
1956年 荷兰 范弟姆特 速率理论
H A BCu u
A：涡流扩散项系数，B：分子扩散项系数， C：传质项系数，ū：平均线速
A，B，C越小，H越小，n越大，柱效高 A，B，C越大，H越大，n越小，柱效低
A-涡流扩散项
起因 由于流动相流经填充物的不规则空隙时，其流动方向 改变，形成紊乱的类似“涡流”的流动而引起
涡流扩散过程示意图
A2dp
n 结论
：填充不规则因子，dp：填充物平均直径
dp越小（采用小颗粒填充物），越小（颗粒均 匀），A就越小
B/ū-分子扩散项（纵向扩散项）
起因：样品在纵向上的浓度梯度而造成的扩散
B2Dg
：弯曲因子，与填充物有关，即由于填充物中固定相颗 粒的存在，使分子自由扩散受到阻碍，扩散程度降低
Dg：组分分子在其气相中的扩散系数，组分分子量大，Dg小； 柱温高， Dg大；柱压大， Dg小；载气分子量大， Dg小 ū ：流动相平均线速
n 结论：采用分子量较大的载气，较高的载气流速，控制较 低的温度，可使分子扩散项系数减小
Cū-传质阻力项
起因：物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过 程中存在的阻力 C C g C l(0 1 . 0k k ') '1 2 2d D p g 23 2(1 k k ' ')2d D fl2