半定量分析方法

半定量又叫半定量PCR半定量是RT-PCR做基因表达分析的一种方法，其操作的方法是在野生型和突变体中用一个看家基因（通常是actin）做参照标准来观察目标基因在各自的表达情况（上调还是下调），所谓半定量的“半”是通俗的说法，即在看电泳图估计参照亮度一致（可看作是表达的细胞数一致）情况下，确定目标基因的表达；这是与更加精确的Q-PCR的相对定量和绝对的量区分。

半定量解释（semi-quantitative interpretation）是介于定性和定量之间的解释。

尽管使用了数学方法对地质目标的空间位置或物性进行了数值计算，也获得了量值，但由于这些方法的使用是有非常严格的前提条件的，而在实际情况下这些条件是不满足的，所以这些定量计算的结果只能从趋势上为解释人员提供参考。

半定量分析定性分析是能区分出是个什么东西。

举个例子来说，你能辨认出这是苹果，但你不能确定是几个苹果。

定量分析是在定性的基础上给出清晰的数量关系。

比如，你确定了这是5个苹果。

而半定量分析是通常实现定量分析非常困难时采取的一种则中办法。

还是举例说明。

这里有一堆苹果，你不知道具体的数量。

但是你能知道的是这一堆苹果能装5麻袋。

这5麻袋的数量估计就是半定量分析。

定量PCR是PCR的一种。

PCR仪目的为了基因扩增。

在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。

PCR的结果需要借助其他手段来检测。

后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。

还可以与荧光技术结合，同时在每个扩增过程都能实施监控。

定量PCR（PolymeraseChainReaction）技术有广义概念和狭义概念。

广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR 起始模板量的定量。

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。

所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。

光谱半定量分析原理、方法、操作技术知识要点一、光谱半定量分析原理光谱半定量分析是根据元素的特征谱线确定被测元素的存在，然后根据谱线的黑度估计其含量的光谱分析。

与目视比色法相似，测量试样中元素的大致浓度范围。

光谱半定量分析法应用：用于钢材、合金等的分类、矿石品位分级等大批量试样的快速测定。

二、光谱半定量分析方法光谱半定量分析的方法有三种：谱线呈现法；谱线强度比较法；均称线对法等。

其中谱线强度法最常用。

谱线呈现法：试样中某元素含量低时，摄谱后在感光板上仅出现少数几根灵敏线，随着试样中该元素含量的增加，一些次灵敏线与原本较弱的谱线相继出现，于是可以编成一张谱线出现于含量的关系表，根据某一谱线是否出现来估计试样中该元素的大致含量。

谱线强度比较法：测定一系列不同含量的待测元素标准光谱系列，在完全相同条件下(同时摄谱)，测定试样中待测元素光谱，选择灵敏线，比较标准谱图与试样谱图中灵敏线的黑度，确定含量范围。

三、光谱半定量分析操作技术（一）、仪器与试剂1.摄谱仪：WSP-1型平面光栅摄谱仪2.电极：下电极¢3.5×6×0. 5 mm碳电极；上电极：圆锥形碳电极,端面直径2 mm3.相板：天津紫外Ⅱ型光谱相板4.投影仪：8W型光谱投影仪5．显影液：取水（35～45℃）700mL、无水亚硫酸钠26.0g、无水碳酸钠20.0g、米吐尔1.0g、对苯二酚5.0g、溴化钾1.0g，加水至1000mL溶解，摇匀备用。

6．停影液：冰醋酸（98%）15mL加水至1000mL，摇匀备用。

7．定影液：取水（35～45℃）650mL、无水亚硫酸钠15.0g、硼酸7.5g、海波240.0g、冰醋酸（98%）15mL、钾明矾15.0g，加水至1000mL溶解，摇匀备用。

（二）、操作步骤1.摄谱前的准备工作（1）准备电极：在光谱分析实验时一般用纯的碳棒作为辅助电极。

（2）将粉状样品用小勺加入电极的样品孔中，或直接将电极压在试样中，填满碳电极小孔。

一种XRD半定量分析X射线衍射（X-ray diffraction，简称XRD）是一种常用的物质结构分析方法，它基于X射线与物质晶格相互作用而产生的衍射现象，通过对衍射图谱的解析可以了解样品的晶体结构、物相组成、晶体缺陷等信息。

在XRD半定量分析中，我们可以利用标准物质的参考谱与待测样品的衍射谱进行比对，从而估算样品中不同成分的含量。

在进行XRD半定量分析前，首先需要选择一个合适的参考标准物质。

理想情况下，参考物质应该与待测样品具有相同或相似的物相组成、结构和晶胞参数，以保证衍射峰的位置和强度对应的准确性。

同时，为了减小可能的衍射峰重叠，还需要选择具有较少或不出现于待测样品衍射图谱中的参考物质。

确定了参考标准物质后，我们可以在同一实验条件下，对参考物质和待测样品进行X射线衍射实验。

实验中通常以不同的角度或2θ扫描样品，并利用X射线衍射仪器记录样品的衍射图谱（也称为衍射曲线）。

实验得到的衍射图谱可以通过相对强度与2θ角度的关系来表达。

接下来，我们需要对实验得到的衍射图谱进行数据处理。

常用的数据处理方法包括峰识别、背景剪除、峰参数提取等。

在XRD半定量分析中，最重要的数据处理步骤是利用参考物质的衍射谱与待测样品的衍射谱进行比对。

通过计算两个衍射谱的相似度指标，可以得到待测样品中不同成分的含量。

XRD半定量分析的数据处理方法主要有定标法和相对强度法两种。

定标法是利用已知含量的标准物质的衍射峰强度与待测物质的衍射峰强度之间的比值关系，建立一个标准曲线，通过对待测物质的衍射峰强度进行插值或外推，估算其含量。

相对强度法则通过衍射峰强度的相对大小关系，对样品中不同成分的含量进行估算。

相对强度法相对于定标法更加简便，但准确性可能较差。

因此，在进行XRD半定量分析时，应该根据具体情况选择合适的方法。

需要注意的是，XRD半定量分析只能得到样品中不同成分的相对比例关系，并不能直接得到其绝对含量。

如果需要获得绝对含量，通常需要通过与其他分析方法（如化学分析）进行结合。

1 半定量RT－PCR 方法的检测步骤1. 1 提取组织或细胞中的总RNA总RNA 的纯度和完整性关系到后面的cDNA合成及PCR 扩增, 因此所提的总RNA 要求纯度高,完整性好并达到一定的浓度. 要达到这一要求, 必须从取标本开始就进行无RNA 酶操作, 以防RNA 酶对所提总RNA 的降解, 具体做法为: 所用的器械及器皿必须经200 ℃以上的高温烘烤最少5 h; 所用的耗材及试剂必须用0. 1% 的DEPC 水处理12～ 16 h,这样方可保证所提总RNA 的完整; 在选用试剂时最好选用知名品牌公司的试剂, 以保证总RNA 纯度及提取的产量; 另外所用的组织量最少应在100mg、细胞数最少应在107.1. 2 总RNA 的纯度和完整性鉴定总RNA 提取之后, 必须用紫外分光光度计测定其纯度和浓度,A 260?A 280 在1. 8～ 2. 0 之间方可采用; 然后再用1. 5% 左右的琼脂糖凝胶对总RNA 进行电泳, 以鉴定其完整性, 浓度不高, 完整性不好的标本最好不用, 以免影响后面的实验结果.1. 3 cDNA 第一链的合成由总RNA 逆转录成cDNA 时, 所取的各组标本的总RNA 的量必须要一样多, 最好在1ug 以上, 这样才能保证各组标本总RNA 中所需检测的mRNA量的差异.为了使逆转录效益最大, 最好采用含有多个碱基的随机序列引物.1. 4 PCR 扩增以逆转录的cDNA 第一链为模板, 以特异性引物扩增所要检测的mRNA. 在PCR扩增时一定要注意以下两点: ①为了克服不同管间扩增引起的“管效益”, 必须以组成型表达的内参基因如β-actin (或其它的看家基因, 如GA PDH、β-M G 等) 为内标, 在同一管中加入扩增内参基因的引物, 共同扩增所要检测的基因和内参基因, 内参扩增产物的大小最好与目的基因mRNA 扩增产物的大小相差200 bp 以上,这样便于观测结果; ②由于PCR 扩增存在着扩增效率及平台期的问题, 因此必须进行预试验以确定待检测基因与内参基因达到平台期前扩增效率最大的循环数. 对于PCR 反应存在着这样的关系式: N =N 0 (1+ E) n. 其中N 0为起始浓度, E 为扩增效率, n代表扩增周期,N 为产物最终浓度. 那么log N = nlog (1+ E) + log N 0. 通过预试验, 在不同的周期取样进行密度扫描, 以待检测基因与内标比值的对数分别与扩增周期作图, 如在20～ 30 周期内, 它们的线性关系良好, 说明在30 周期内二者的扩增未到达平台期, 最后确定扩增效率最大的循环数, 这样可有效地避免因引物结合效率不同而引起的误差.1. 5 结果的分析根据扩增产物片段的大小配制最适宜浓度的凝胶, 将PCR 扩增产物进行电泳.待检基因与内参基因的扩增条带应相隔一定的距离(最少200 bp 以上) , 以便于观测结果及密度扫描, 且所选用的Marker 应尽量含有与扩增产物相对应的条带. 电泳条带经密度扫描仪扫描, 得到待测基因与内参基因条带各自的峰面积积分值, 计算各组样品两者的比值. 为了使扩增条带密度扫描的峰面积积分值尽量的准确可靠, 电泳条带一定要清晰, 不能有杂带出现. 有杂带出现的标本最好不用, 若有杂带应重新调整PCR 过程中的退火温度, 直至杂带消失, 这样才能保证扫描结果的专一性及可靠性.2 半定量RT -PCR技术的关键因素2. 1 总RNA 和cDNA 的质量只有在总RNA 未被降解的情况下, 才能保证其中mRNA 的完整性和随后反转录的cDNA 的质量,从而真实反映基因的表达.2. 2 总RNA 的定量在反转录之前, 作为起始模板各个样品中的总RNA 量要一样, cDNA 量和电泳PCR 产物量也要一样, 这样才能保证PCR 扩增产物能真实反映基因表达的实际情况.2. 3 引物的选择PCR反应的特异性是由一对上下游引物所决定的, 因此引物的好坏往往是PCR 反应成败的关键. 引物包括扩增目的基因的引物及扩增内参基因的引物, 引物的设计, 要根据基因的非保守序列设计, 以保证扩增的特异性.2. 4 PCR 循环数的确定选择合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖凝胶上清晰可见和定量, 也可使扩增反应在到达平台期前的线性范围内进行.在RT-PCR 方法中, 反应的循环数是一个必须分析的参数. PCR 扩增产物的量与循环数之间有一线性关系. 前期的扩增产物量随循环数的递增而成比例增加. 随着DNA 聚合酶活性的下降和溶液中反应底物的消耗, 扩增产物将达到一个平台. 半定量分析的循环数应确定在成比例的线性关系范围内. 表达丰度不同的基因半定量分析的PCR 循环数不同.PCR 扩增反应是酶促反应, 遵循酶促反应定律, 开始的循环内扩增产物呈指数累积, 产物与模板呈线性关系, 半定量RT-PCR 技术正是利用产物与模板的这一线性关系, 通过扩增产物来对比总RNA 中目的基因的表达, 但经过一定的循环后, PCR 产物不再呈指数累积而进入平台期, 在平台期低水平表达的目的RNA 可能会增加到与高水平表达的目的RNA 相同的浓度, 因此, 为避免平台效应的影响, 合适的循环数是PCR 半定量方法的关键因素之2. 5 最佳Mg2+ 浓度的确定M g2+ 浓度对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响, 因为它是影响Taq 酶扩增效率的重要因素,除此之外,M g2+ 还可影响引物的退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等. 浓度范围多在0. 5～ 5 mmo lPL , 但扩增的效率则主要视序列而定. 在一般的PCR 反应中, 各种dNTP 浓度为200 umo lPL 时,M g2+ 浓度为1. 5～ 2. 0 mmolPL 为宜. M g2+ 浓度过高, 反应特异性降低, 出现非特异性扩增, 浓度过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性, 使反应产物减少. 实验过程中可分别取1. 0、1. 5、2. 0mmo lPLMg2+ 进行预实验, PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后, 通过鉴定其亮度和特异性, 来确定最适的M g2+ 浓度.2. 6 合适内参的选择设立内参照可以减少因RNA 定量时产生的误差, 也可消除细胞个数的差别所带来的误差. 为避免RNA 抽提、加样、测量、cDNA 合成及PCR 反应过程中的某些系统误差和人为误差, 实验要选用在生物体内稳定表达且在其它生理条件下不受影响或影响很小的持家基因片段作为内参.传统的半定量RT-PCR 技术多以β-act in 作内参, 另外常用的内参照还有GAPDH, 它是一种细胞内代谢酶, 其基因属于保守性强的“管家基因”, 该基因在生物体内普遍存在且稳定表达. β-M G 也是常用的内参, 研究表明18 S rRNA 具有更强的保守性和更普遍而恒定表达的特性, 因此在很多情况下也常常被用作内参. 不同的生物体其生命过程和生理过程各不相同, 选用何种内参要根据目的基因和实验的具体情况而定.3 半定量RT-PCR 法的应用半定量RT-PCR 是目前研究基因转录水平的有效手段, 可用来检测基因表达及其变化状况, 并可进行定量分析, 万平等以微管蛋白基因(Tubulin) 为对照,利用半定量RT 2PCR 法研究发现小麦锌指蛋白基因(TazF) 属于组成型表达基因. 王维平等以水稻肌动蛋白基因(Actin) 为对照, 利用半定量RT-PCR 研究, 发现水稻RCOI1基因的表达受茉莉酸甲酯(MeJA) 的诱导. 同时半定量RT 2PCR 方法在病原体检测、转基因的安全检测及肿瘤的研究方面也有非常广泛的应用.4 总结与展望半定量RT-PCR 法除了要求反转录和PCR条件完全一致外, 相比较样品之间最好同批进行RT -PCR , 对于用凝胶扫描检测PCR 扩增产物来说, 更适宜在同一块凝胶上进行电泳分离. 如果样品数量多, 由于泳道限制, 就不能同时在一块胶上电泳. 这时可采用Life Technologies 公司的定量Marker, 通过计算分析,得到PCR 扩增产物的含量, 这样就可对同批扩增的样品进行多次重复电泳检测, 以提高定量的准确性和可靠性. 另外采用反转录与PCR分开进行的两步法RT-PCR , 在实验摸索阶段较一步法RT-PCR更为经济和方便, 因为每次提取到的总RNA 立即反转录成cDNA 存放, 可以尽量避免RNA操作中的降解, 而且一次反转录的cDNA 模板可供多次PCR 使用, 不但节约成本还可缩短实验周期,提高实验成功率.若靶基因的模板量大大低于内参基因, 若按常规方法同时加入两种基因的引物进行PCR 扩增, 在同一PCR 体系中, 太高浓度的模板会竞争性地形成优势扩增, 从而使另一模板失去指数扩增. 同时, 由于PCR 扩增中“平台期”的影响, 当靶基因可用EB检测出时, 内参基因已快进入“平台期”. 因此可采用PCR 扩增时内参照引物滞后加入的方法, 使内参照与靶基因同时处于指数增长期, 这样就可避免内参的优势扩增. 另外半定量RT - PCR 检测体系必须防止混在RNA 中的基因组DNA 带来的假阳性. 为排除可能的污染, 在实验中可同时设置两个阴性对照,一是以mRNA 为模板直接进行PCR 反应, 另一组不加任何模板. 若含有基因组DNA , 则会有条带出现.总之, RT-PCR 法是讨论基因转录水平的有效手段, 利用RT 2PCR 法对mRNA 进行半定量分析,最关键的是优化实验条件, 寻求PCR 线性扩增范围, 确定最适M g2+ 浓度和PCR 循环数. 但是要使该法能够较准确地定量, 还有许多要注意的问题, 如在进行目的基因的定量分析过程中尚需考虑目的基因和内对照基因的丰度、大小以及它们的引物长短对扩增反应的影响, 另外就定量分析而言, 要使PCR产物量能够较好地反映起始模板量, 必须对处于指数扩增阶段的产物进行检测, 而它是不能通过EB 染色检测到的, 这是在利用常规PCR 方法分析目的基因表达变化过程中常遇到的难题, 大多数实验室常将定量分析过程中的PCR 扩增循环数提高到30 甚至35 个循环, 但是, 往往导致实验失败, 因此, 寻求一种高灵敏度的检测核酸数量变化的方法是今后需要努力去做的工作.。

光谱半定量分析光谱半定量分析00在实际工作中，有时只需要知道试样中元素的大致含量，不需要知道其准确含量。

例如钢材与合金的分类、矿产品位的大致估计等等，另外，有时在进行光谱定性分析时，需要同时给出元素的大致含量，在这些情况下，可以采用光谱半定量分析。

所以光谱半定量分析的任务就是给出试样中某元素的大致含量。

光谱半定量分析的方法有三种：谱线呈现法；谱线强度比较法谱；均称线对法等。

其中线强度比较法最为常用。

1．谱线呈现法谱线强度与元素的含量有关。

当元素含量的降低时，其谱线强度逐渐减弱，强度较弱的谱线渐次消失，即光谱线的数目逐渐减少。

因此，可以根据谱现出现的条数及其明亮的程度判断该元素的大致含量。

例如：Pb含量（%）谱线λ(nm)0.001 283.3069清晰可见，261.4178和280.200很弱0.003 283.306、261.4178增强，280.200清晰0.01 上述谱线增强，另增266.317和278.332，但不太明显。

0.1 上述谱线增强，无新谱线出现1.0 上述谱线增强，214.095、244.383、244.62出现，241.77模糊3 上述谱线增强，出现322.05、233.242模糊可见10 上述谱线增强，242.664和239.960模糊可见30 上述谱线增强，311.890和269.750c出现2．谱线强度比较法光谱半定量分析常采用摄谱法中比较黑度法，这个方法须配制一个基体与试样组成近似的被测元素的标准系列（如，1%，0.1%，0.01%，0.001%）。

在相同条件下，在同一块感光板上标准系列与试样并列摄谱，然后在映谱仪上用目视法直接比较试样与标准系列中被测元素分析线的黑度。

黑度若相同，则可做出试样中被测元素的含量与标准样品中某一个被测元素含量近似相等的判断。

例如，分析矿石中的铅，即找出试样中灵敏线283.3 nm，再以标准系列中的铅283.3nm线相比较，如果试样中的铅线的黑度介于0.01% ~ 0.001%之间，并接近于0.01%，则可表示为0.01% ~ 0.001%。

半定量又叫半定量PCR半定量是RT-PCR做基因表达分析的一种方法，其操作的方法是在野生型和突变体中用一个看家基因（通常是actin）做参照标准来观察目标基因在各自的表达情况（上调还是下调），所谓半定量的“半”是通俗的说法，即在看电泳图估计参照亮度一致（可看作是表达的细胞数一致）情况下，确定目标基因的表达；这是与更加精确的Q-PCR的相对定量和绝对的量区分。

半定量解释（semi-quantitative interpretation）是介于定性和定量之间的解释。

尽管使用了数学方法对地质目标的空间位置或物性进行了数值计算，也获得了量值，但由于这些方法的使用是有非常严格的前提条件的，而在实际情况下这些条件是不满足的，所以这些定量计算的结果只能从趋势上为解释人员提供参考。

半定量分析定性分析是能区分出是个什么东西。

举个例子来说，你能辨认出这是苹果，但你不能确定是几个苹果。

定量分析是在定性的基础上给出清晰的数量关系。

比如，你确定了这是5个苹果。

而半定量分析是通常实现定量分析非常困难时采取的一种则中办法。

还是举例说明。

这里有一堆苹果，你不知道具体的数量。

但是你能知道的是这一堆苹果能装5麻袋。

这5麻袋的数量估计就是半定量分析。

定量PCR是PCR的一种。

PCR仪目的为了基因扩增。

在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。

PCR的结果需要借助其他手段来检测。

后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。

还可以与荧光技术结合，同时在每个扩增过程都能实施监控。

定量PCR（PolymeraseChainReaction）技术有广义概念和狭义概念。

广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR 起始模板量的定量。

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。

所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。

原子发射光谱（Atomic Emission Spectrometry，AES）是一种利用物质在热激发或电激发下，每种元素的原子或离子发射特征光谱来判断物质的组成，进行元素的定性与定量分析的方法。

原子发射光谱法具有多元素检测、分析速度快、选择性好、检测限低、准确度高、误差较小、试样消耗少、线性范围大等优点。

然而，它也存在一些局限性，如不能非金属、光谱复杂、价格昂贵等。

在原子发射光谱法中，定量和半定量的分析主要依据以下原理：
1. 定量分析：通过测量待测物质中各元素的发射光谱强度，与标准光谱强度进行比较，从而计算出待测物质中各元素的含量。

常用的定量分析方法有：标准曲线法、标准加入法、内标法等。

2. 半定量分析：通过比较待测物质中某元素的发射光谱与已知浓度的标准物质光谱，对待测物质中该元素的含量进行大致估算。

半定量分析常用的方法有：目视法、比较法等。

在实际应用中，原子发射光谱法可对约70 种元素（包括金属元素及磷、硅、砷、碳、硼等非金属元素）进行分析。

在一般情况下，用于1% 以下含量的组份测定，检出限可达ppm，精密度为10% 左右，线性范围约2 个数量级。

这种方法可有效地用于测量高、中、低含量的元素。

化学计量实验教案：半定量分析的方法和应用半定量分析的方法和应用化学计量实验是化学教育中的重要实验之一，是化学学科中非常重要的一个分支。

化学计量实验是以化学计量基本原理为基础，通过实验技术和方法来进行定量或半定量分析的一种实验方法。

化学计量实验的应用非常广泛，可以用于环境监测、食品检验、药品制造等领域。

本文将重点介绍化学计量实验中的半定量分析方法和应用。

一、半定量分析的方法半定量分析是一种只能得到样品中化学物质约定量的方法。

下面列举几种半定量分析常用的方法：1、滴定法滴定法是一种利用滴定液与被测液体反应生成定量产物的方法。

该方法可以用于计算定量的物质，但是无法得到准确的结果。

因此，它通常是被用于半定量分析。

滴定法的基本原理是利用滴定液中的一种化学物质来与被测液体中的目标化学物质反应，生成定量产物，如常用的KMnO4滴定法、HClO4滴定法等。

2、分光光度法分光光度法是一种可以利用吸收特定波长的光来测定化学物质浓度的方法。

它基于分子吸收光的本质，可用于半定量或使用校准曲线来进行定量分析。

该方法又称分光光度测定法，常用于分析痕量元素。

3、比色法比色法是利用化学物质与某种显色剂反应，使溶液颜色发生变化进行半定量分析的一种方法。

该方法与分光光度法的原理类似，但是常常受到样品矩阵干扰的影响。

二、半定量分析的应用1、环境监测半定量分析在环境监测中应用广泛，可以用于测定水、大气、土壤等中的污染物含量。

如利用滴定法测定水中硬度离子的含量、利用光度法测定大气中氧化物浓度的方法等。

2、食品检验食品安全问题一直是人们所关注的话题，半定量分析方法在食品检测中有着非常重要的应用。

如利用比色法检测食品中的添加剂、利用滴定法测定食品中盐分含量、利用分光光度法测定食品中的微量元素等。

3、药品制造半定量分析方法在药品制造中也应用广泛。

如利用分光光度法检测药品中的杂质、利用滴定法测定药品中有效成分的含量、利用比色法测定药品中添加剂的含量等。