蛋白质的分离纯化1

蛋白质分离纯化的注意事项蛋白质分离纯化是生物学和生物化学研究中常用的一个步骤，它用于将混合的蛋白质溶液中的目标蛋白质分离出来并去除杂质。

蛋白质分离纯化的注意事项有很多，下面将详细介绍。

1. 样品的制备：蛋白质的分离纯化前，首先需要对样品进行合适的制备。

采集样品时要避免污染、破坏或降解蛋白质。

样品的pH、温度和离心速度等因素对蛋白质的稳定性有重要影响，因此需要根据实验需要进行适当的处理。

2. 分离纯化方法的选择：根据不同的蛋白质性质和研究目的，选择合适的分离纯化方法。

常用的方法包括离心法、沉淀法、过滤法、电泳法、层析法等。

在选择方法时要考虑到分离纯化的效果、时间、成本、操作难度等因素。

3. 分离纯化条件的优化：在选择分离纯化方法后，需要对实验条件进行优化。

例如，选择合适的缓冲液和pH，优化温度和离心速度，调整柱层析的流速和梯度，以及优化电泳条件等。

优化条件可以提高蛋白质的分离纯化效果。

4. 对蛋白质的保存和稳定性需小心处理：蛋白质容易受到温度、pH、氧化和降解等因素的影响而失活。

因此，在整个分离纯化的过程中，要注意进行低温处理，避免酶的降解和氧化反应的发生。

此外，还可以使用蛋白质稳定剂，如甘油、蔗糖或明胶等，来延长蛋白质的保存时间。

5. 删除杂质的步骤：蛋白质分离纯化的一个重要目标是去除杂质。

去除杂质的方法包括胶体沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、离心沉淀等。

选择适当的去除杂质的方法，能够提高分离纯化的纯度。

6. 纯化后的保存：在完成蛋白质的分离纯化后，必须妥善保存纯化蛋白质。

纯化蛋白质容易受到冻融循环、氧化和结构变化等因素的影响，因此需要在低温下保存，并加入适当的保护剂以避免降解。

7. 纯度和活性的鉴定：对于蛋白质分离纯化后的样品，需要进行纯度和活性的鉴定。

常用的鉴定方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting、质谱分析、酶活分析等。

这些鉴定方法能够确定纯化蛋白质的纯度和活性，从而确定分离纯化的效果是否达到预期目标。

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。

常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。

这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。

在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。

(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法:1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。

被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。

能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。

此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。

由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。

蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。

提取的温度要视有效成份性质而定。

一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。

但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。

为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。

用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。

同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。

升浓度为宜。

缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。

但必需在低温下操作。

丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。

另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。

本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。

关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。

据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。

由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。

纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。

但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。

与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。

目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。

重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。

因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。

90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。

本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。

1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。

蛋白质分离纯化的方式分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。

1.前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态（如果做不到呢？比如蛋白以包涵体形式存在），不丢失生物活性。

为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点（为什么呢）的有机溶剂如乙醚等脱脂。

然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。

动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。

植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。

细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。

破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。

组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。

细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。

如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。

2.粗分级分离：当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。

一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。

这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。

有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。

3.细分级分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。

分离纯化蛋白质的方法及原理本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March分离纯化蛋白质的方法及原理（一）利用分子大小1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。

方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：如何加快透析过程（1）加大浓度差，及时更换透析液（2）利用磁力搅拌器常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。

而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。

结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来（二）利用溶解度差别4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。

5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析（三）根据电荷不同6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。

电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。

所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。

7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。

蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质是生物体内重要的功能分子，它们在细胞的结构和功能中扮演着重要角色。

蛋白质的纯化和分离是研究蛋白质结构和功能的基础。

本文将介绍蛋白质分离纯化的一般原则和方法。

蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。

蛋白质具有不同的分子量、电荷、溶解性、亲疏水性等特性，可以通过这些特性来实现蛋白质的分离纯化。

蛋白质分离纯化的第一步是提取蛋白质。

提取蛋白质的方法有多种，常见的包括机械破碎、超声波破碎、溶剂提取等。

提取蛋白质的目的是将其从细胞或组织中释放出来，为后续的分离纯化步骤做准备。

蛋白质的分离纯化可以通过多种方法来实现。

其中最常用的方法是色谱技术。

色谱技术基于蛋白质的物理化学性质，将混合溶液中的蛋白质分离开来。

常见的色谱技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱、逆相色谱等。

凝胶过滤色谱是一种基于蛋白质分子量的分离方法。

其原理是通过孔径大小选择性地分离不同分子量的蛋白质。

凝胶过滤色谱常用于蛋白质的初步分离和浓缩。

离子交换色谱是一种基于蛋白质电荷的分离方法。

其原理是通过蛋白质与离子交换基质之间的相互作用来实现分离。

离子交换色谱可以根据蛋白质的电荷性质选择性地分离不同电荷的蛋白质。

亲和色谱是一种基于蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用来实现分离的方法。

亲和色谱可以利用蛋白质与亲和基质之间的特异性结合，选择性地分离目标蛋白质。

逆相色谱是一种基于蛋白质亲疏水性的分离方法。

其原理是利用蛋白质与逆相基质之间的亲疏水作用来实现分离。

逆相色谱可以根据蛋白质的亲疏水性选择性地分离不同性质的蛋白质。

还有一些其他的蛋白质分离纯化方法，如电泳、超高速离心、超滤等。

这些方法在特定的实验条件下可以实现蛋白质的分离纯化。

蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。

通过选择合适的分离纯化方法，可以有效地分离出目标蛋白质，并去除其他杂质。

蛋白质的纯化程度越高，其质量和活性也就越好，对于后续的研究和应用具有重要意义。

简述重组蛋白分离纯化的基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。

本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。

关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。

对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。

蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。

本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。

1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。

2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。

例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。

有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。

3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。

4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。

1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。

请举四种蛋白质类制品分离纯化方法,并说明一下其原理
以下是四种蛋白质类制品分离纯化方法及其原理的举例:
1. 盐析法：盐析法是利用蛋白质在不同盐浓度下溶解度的差异进行分离纯化。

具体来说，在蛋白质溶液中添加适量中性盐，使得蛋白质的溶解度降低并析出，从而达到分离纯化的目的。

这种方法的原理是蛋白质与盐离子形成复合物，且复合物的溶解度较低，因此在盐浓度较高时，蛋白质会沉淀出来。

2. 等电点沉淀法：等电点沉淀法是利用蛋白质在不同 pH 值下的等电点进行分离纯化。

具体来说，将蛋白质溶液调节至其等电点 pH 值，使得蛋白质失去电荷，形成稳定的沉淀，从而达到分离纯化的目的。

这种方法的原理是蛋白质在不同 pH 值下带电荷的数量不同，因此在等电点时，蛋白质会沉淀出来。

3. 低温有机溶剂沉淀法：低温有机溶剂沉淀法是利用蛋白质在低温下溶解度的差异进行分离纯化。

具体来说，将蛋白质溶液引入与水可混溶的有机溶剂中，使得蛋白质的溶解度降低并析出，从而达到分离纯化的目的。

这种方法的原理是蛋白质在水中的溶解度受温度和溶剂性质的影响，而在有机溶剂中，蛋白质的溶解度较低，因此可以分离纯化。

4. 亲和色谱法：亲和色谱法是利用蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离纯化。

具体来说，利用具有特异性结合能力的载体，将待分离的蛋白质与载体结合，然后通过改变洗脱液 pH 值或离子强度等方法，将结合在载体上的蛋白质洗脱出来。

这种方法的原理是蛋白
质与配体之间的相互作用可以影响蛋白质的溶解度、电离性质等，从而进行分离纯化。

蛋白质的分离纯化技术1、根据蛋白质带电性质不同的分离技术1.1离子交换层析以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋白质和多肽的带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同而得到分离。

其可分为阳离子柱和阴离子柱两大类, 还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。

离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。

当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。

随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附能力从小到大的顺序先后洗脱下来。

1.2电泳法电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。

蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。

现在常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以因不同蛋白质所带电荷的差异和大小差异高分辨率地分离或分析蛋白质。

在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,可以消除蛋白质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统是测定蛋白质的相对分子质量最常用的方法。

2、根据蛋白质溶解度不同的分离技术2.1蛋白质的盐析蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。

2.2有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。

近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原来包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。

利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。