生物碱类药物的分析
掌握盐酸麻黄碱、硫酸阿托品、硫酸奎宁、盐酸吗啡和硝酸士的宁的鉴别、杂质检查和含量测定方法。
一、概述
（一）定义：生物碱是一类存在于生物体内的含氮有机化合物。
（二）分类
1.芳烃胺类
硫酸苯丙胺，精神振奋药pKb=9.9
盐酸麻黄碱，肾上腺受体激动药pKb=9.6
2.异喹啉类
盐酸吗啡，镇痛药pKb1=8.0，pKb2=9.9
磷酸可待因，镇痛镇咳药；盐酸黄连素，抗菌药；度冷丁等
3.喹啉类
硫酸奎宁，抗疟药；异构体硫酸喹尼丁，抗心率失常药；
pKb1=5.07，pKb2=9.7
4.托烷类
硫酸阿托品，抗胆碱药pKb=9.9
氢溴酸东莨菪碱，抗胆碱药pKb=7.6；
5.黄嘌呤类
咖啡因，pKb=14.15（碱性极弱）；
茶碱，平滑肌松弛药，含活泼氢酸性；
6.吲哚类
硝酸士的宁，中枢神经兴奋药pKb1=6.0，pKb2=11.7（酰胺）
硫酸长春新碱，抗肿瘤药；利血平，抗高血压药；
7.其他类
硝酸毛果芸香碱，缩瞳药。
由上可知，生物碱类药物有如下特点。
（三）特点
1.数量多，绝大多数存在于植物体内；已发现3000多种，100多种有效，中成药中富含生物碱。
2.生理活性强，但大都有毒性
因此，质量控制和临床应用尤应慎重，许多为特殊管制药物，并已超出药物分析的范畴，体育运动中的兴奋剂问题，世界关注的毒品问题，许多是生物碱类成分。该类药物的质量应严格控制，以保证用药的安全和有效。
（四）结构特征和分析方法间的关系
1.碱性：N原子的存在，强弱从N上的取代基是供电子还是吸电子基团，空间位阻两方面考虑。
1）一般情况：季铵>仲铵>伯铵>叔铵>NH3>环酰铵
2）脂肪铵>脂环铵>芳铵
3）个别两性化合物如吗啡有酸性（酚羟基），茶碱只有酸性（活泼氢）
2.存在状态多数以盐的形式存在
1）植物中多与有机酸成盐如吗啡罂粟酸盐，鞣酸奎宁盐；
2）药用多为多为无机酸盐如盐酸、硫酸、磷酸和硝酸盐。
含量测定应考虑上述2个因素，碱性强弱选择滴定溶液和指示剂，成盐的情况在非水滴定时要考虑对滴定的干扰。
3.溶解性
1）共性：游离生物碱易溶于CHCl3等中等极性有机溶剂，难或不溶于水，溶于稀酸溶液；成盐易溶于水；（提问？）
2）个性：两性和酸性化合物易溶于稀碱溶液（吗啡和茶碱）；麻黄碱和咖啡因能溶于水；咖啡因和利血平碱性极弱，不能与酸结合成稳定的盐。
溶解性可以用于提取分离和鉴别时的重要依据。
4.光谱特点
1）旋光性多含不对称碳原子，故有旋光性，药效学研究表明许多手性药物一般效用不同，或药效有强弱、或效价低、或无效，甚至有毒副作用。如今手性合成和分离是药学研究的热点和难点之一；
2）紫外吸收多含不饱和双键。
5.与生物碱沉淀试剂和显色试剂反应
上述是生物碱类药物的一般共性。
6.取代基的性质（个性）
1）氨基醇（苯丙胺、伪麻黄碱）
（1）还原性：可与高锰酸钾等氧化剂反应生成甲胺，有碱性；
（2）双缩脲反应：硫酸铜和氢氧化钠试液反应生成蓝紫色配位化合物；
2）酚羟基（吗啡）Marquis反应硫酸-甲醛氧化成醌，显色；
3）酯的结构（托烷类）Vitaili反应
如阿托品水解成莨菪酸，可与发烟硝酸共热，生成黄色硝基衍生物。
4）奎宁类（喹啉类）绿奎宁反应，微酸性水溶液，滴加Br2或Cl2水，加过量氨水，呈翠绿色；
5）异喹啉类（黄连素）热碱（NaOH）作用，转变为季铵盐碱性及其互变异构体，呈橙红色，与丙酮作用，生成黄色沉淀；
6）黄嘌呤类（咖啡因）紫脲酸铵反应，HCl，KClO3，加热放出氨气呈紫色，加碱消失；
7）吲哚类生物碱（士的宁、利血平和长春新碱）呈吲哚颜色反应，如与香草醛试剂反应。
二、鉴别
（一）熔点鉴别法
熔点测定是一种常用初步鉴别药物的方法，在药典附录中都规定有详细的测定方法。所测熔点受结晶和测定条件影响大，有许多化合物的熔点相近，易混淆，所以，利用反应生成难溶于水的衍生物，测熔点，增加专属性，来帮助判断。
生物碱类常用四苯硼钠和芳磺酸类与之反应，测熔点。
方法：供试品水和冰醋酸酸化过量四苯硼钠水浴70℃沉淀过滤干燥测熔点。
（二）旋光鉴别
手性碳原子旋光测定鉴别（旋光度）
方法：供试品水一定浓度测旋光度α，计算比旋度，与标准对比对照鉴别。
该法可用于鉴别、检查和含量测定。
（三）沉淀反应和显色反应
常用生物碱沉淀试剂：KI-I2，KBiI4，KhgI3和苦味酸（三硝基苯酚）试液，其他还有磷钨酸、磷钨酸钼、鞣酸、HgCl2等试液，通过沉淀颜色和结晶情况，用于鉴别或互相区别；
显色试剂：甲醛硫酸试液，浓硝酸、浓硫酸等等，通过氧
化，脱水，缩合等反应显色，用于鉴别，也可用于TLC的显色剂。
三、含量测定
多数生物碱类药物均以成盐的形式作为原料，简写为BH+·A-，游离生物碱的碱性较弱，而所用酸为无机酸，酸性强，从广义酸碱理论可以认为是个强酸弱减性的两性药物，从化学分析角度，可用强碱置换弱减滴定，即置换滴定，课后自学；同时，生物碱盐的弱减性一般为pKb8~10，可以用非水HClO4直接滴定。
利用游离生物碱溶于有机溶剂，盐溶于水的性质，我们可用萃取方法，经分离后测定，即提取中和法。
利用生物碱盐在一定的pH条件下，与酸性染料定量反应形成离子对，且离子对易溶于有机溶剂的性质，进行酸性染料比色法测定。
（一）非水溶液滴定法
各国药典大部分采用此方法，使滴定突跃明显，并能溶解游离生物碱。
1.原理：BH+·A-+HClO4=BH+·ClO4-+HA
2.方法：供试品精密称定（≈消耗标准液6~8ml）冰醋酸10~30ml溶液，0.1mol/LHClO4滴定至终点。（指示剂或电位法指示终点）
3.讨论
1）适用范围：pKb在8~10之间，小于8可用水溶液滴定，大于10用醋酸作溶剂无明显突跃，一般不能滴定，绝大多数生物碱在8~10；若要滴定pKb大于10的生物碱，需加入醋酐作溶剂，咖啡因pKb为14.5，BP、USP和ChP均采用醋酐作溶剂进行非水滴定测含量；
2）酸根的影响
生物碱盐中被置换出的无机酸，只有在HAc溶液中为弱酸，才能使反应定量完全，或说反应到底，才不影响HClO4的滴定，若不是弱酸，怎么办？我们先看一下在冰醋酸中，酸性的强弱情况
高氯酸>氢溴酸>硫酸>盐酸>硝酸>硫氢酸根>磷酸
以下醋酸中为弱酸
（1）硝酸在冰醋酸中为弱酸，能使反应完全，不影响滴定，但硝酸要氧化指示剂，干扰滴定，且突跃不明显，用电位指示终点；
（2）氢溴酸和盐酸为强酸，存在使反应无法定量进行，可加入醋酸汞冰醋酸溶液，形成难以解离的HgX2，而使反应完全，排除干扰。
（3）硫酸一级电离是强酸，二级电离是弱酸，在冰醋酸中显示为一元酸，滴定至硫氢酸盐，因此，要注意滴定度的计算，一元生物碱的硫酸盐用高氯酸滴定时是1：1mol反应；若是二元生物碱时是1：3mol反应，计算滴定度时要除以3；也有人用氯化钡除去硫酸根，在滴定，以1：2mol反应。
3）方法评价
（1）简便、快速，尤其适合原料；
（2）专一性差，实际上是置换滴定，滴定阴离子；
（3）硝酸要注意氧化性，用电位法。
（二）提取中和法
1.原理和方法：供试品水溶液氨水、氯仿氯仿层，蒸干，测定
1）提取：加氨试液等使生物碱游离，用有机溶剂氯仿等定量提取，蒸干后；
2）直接滴定；
3）剩余酸量法加过量酸溶解，碱回滴。
2.讨论
1）碱的选择：多用NH3·H2O，太弱，游离不完全；太强有影响
（1）若是两性生物碱（吗啡），强碱溶于水；
（2）有些生物碱中有酯的结构，易水解；
（3）萃取使易乳化，不易分层。
2）提取溶剂应与水互溶性小，易溶解形成的离子对，不易乳化，常用氯仿为提取溶剂；
3）指示剂的选择等电点的pH值应在指示剂的变色范围内；
4）乳化的预防和消除课后自学。
3.方法评价
1）专一性经分离后测定生物碱，有一定专一性；
2）缺点费时，繁琐。
（三）置换滴定（课后自学）
1.原理生物碱水溶液用0.01mol/LNaOH直接滴定
强碱置换出生物碱，由于生物碱的碱性在pH8~10，常用酚酞作指示剂。
2.影响因素
1）生物碱的碱性强，干扰指示剂终点的变色范围；
2）游离生物碱不溶于水，使溶液混浊，影响终点的观察；
3.解决方法
1）加乙醇使生物碱碱性减弱；
2）加氯仿等有机溶剂，提取溶解生物碱；此种方法由于存在两相，所以，又称双相滴定。
（四）酸性染料比色法
1.原理在一定pH值条件下，生物碱盐的阳离子和酸性染料的阴离子定量结合生成配位化合物，即离子对，此离子对易溶于有机溶剂，经有机溶剂（氯仿等）提取后，比色测定含量。
（BH+）W+（ln-）W（BH+·ln-）W（BH+·ln-）O
2.方法中国药典95版，氢溴酸东莨菪碱的含量测定
3.讨论
1）pH值的选择是本法至关重要的条件（依据原理的反应式讲解）
（1）pH值过低抑制酸性染料的解离，使ln-浓度太低，影响离子对的形成；
（2）pH值过高生物碱呈游离状态，不利离子对的形成。
2）酸性染料的选择
1.能定量完全反应；
2.形成的离子对在有机溶剂中有较好的溶解度；
（3）常用溴麝香草酚蓝和溴甲酚绿。
3）有机溶剂的选择氯仿常用
1.与水难混溶；
2.离子对提取率高，难溶酸性染料；
3.离子对溶液的吸收率高。
4）水分的影响严防水分混入有机溶剂中，水相中有有色的有机染料，并能是氯仿浑浊，影响比色。
5）酸性染料的浓度只要不产生乳化，增加浓度可提高测定灵敏度；
6）有色杂质的排除可先用有机溶剂提取酸性染料中有色杂质。
（五）色谱分析
生物碱类药物可用GC和HPLC法测定。
（六）阴离子表面活性剂滴定法
复习要点
1.熔点法和旋光法鉴别的原理、方法和适用对象；
2.药物的酸碱性不同，如何选择和建立相应的含量测定方法，非水溶液对强酸弱减盐滴定法中消除无机酸干扰的方法；
3.酸性染料比色法的原理、方法、影响因素、
条件选择和适用对象；
4.萃取分离分析中条件的选择和优化。
生物碱类药物的分析
1、典型药物的结构和性质
2、本类药物特殊的鉴别反应：
（1）双缩脲反应：笨烃胺类之特征反应，试剂及现象；（2）Vitali反应：托烷类之特征反应，试剂及现象；（3）绿奎宁反应：含氧喹啉类之特征反应，试剂及现象；（4）Marguis反应：异喹啉类之特征反应，试剂及现象；（5）紫脲酸铵反应：黄嘌呤类之特征反应，试剂及现象；
3、本类药物中特殊杂质的检查方法。
4、本类药物的含量测定方法：
（1）非水溶液滴定法，
原理
注意事项；
（2）提取中和法：
原理、
测定条件和选择；
（3）酸性染料比色法：
原理、
影响定量分析的因素。