载体双酶切位点选择

引物设计原则及酶切位点选择和设计：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用[整理]载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来T连入质粒中的重要目的酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

只能切一个，酶都切不好。

因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如promega的说明书上说，最好隔四个。

我看AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

的酶。

最好使用双酶切有共同buffer最好使用自己实验室有的酶，这样可，ecor1等），最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1以省钱。

的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

的计算，关于TmTm大家可以理解，双链溶解所需的温度。

即是DNA叫溶解温度（melting temperature, Tm），Tm因此，的溶解是没有作用的。

而不互补的区域对DNA 这个温度是由互补的DNA区域决定的，（除时，只计算互补的区域Tm才有贡献。

计算Tm只有和模板互补的区域对对于引物的Tm，过低，是因为他们误把保护碱。

不少战友设计的引物都Tm 非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。

2024届高三生物提分攻略：如何选取限制酶选择限制酶时需要考虑哪些因素？①为了防止目的基因、载体自身环化和及2者的反向连接，尽量选择双酶切法，选择2种限制酶。

②酶切位点位于目的基因两侧，不能破坏目的基因；③不能破坏启动子、终止子、复制起原点。

④通常选择含有目的基因的DNA片段和载体上共有的酶切位点，或者能产生相同黏性末端的限制酶；⑤若载体上有2个及以上的标记基因，为了便于筛选，通常需要破坏一个标记基因；若载体上只有1个标记基因，不破坏这个标记基因。

⑥考虑转录的方向，需要将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，且考虑到目的基因插入后能正常转录出正确的RNA。

1、构建重组质粒时可选用四种限制酶，其识别序列如下图。

为防止酶切片段的自身环接，不可选用的限制酶组合是（）A.①③B.②③C.①④D.③④2、若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ（－A↓GATCT－），EcoRⅠ（－G↓AATTC－）和Sau3AⅠ（－↓GATC－）。

下列分析合理的是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRI切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体3、获得相关基因后，利用PCR技术进行融合得到目的基因，可选择与乳腺细胞表达载体pBC1构建重组DNA 分子。

目的基因、表达载体pBCl如图乙所示。

①PCR扩增图示目的基因时需加入种引物和酶。

②本实验应选择限制酶切割目的基因与pBCl载体，将酶切产物正确连接后形成重组DNA分子，以便后续通过荧光检测筛选。

4、人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经加工后形成具有两条肽链（A链和B链）的有生物活性的胰岛素。

此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。

引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。

Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。

不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。

【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。

现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。

Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。

不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。

双酶切连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp ×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

原核表达操作步骤及注意事项将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

载体结构设计酶切位点和引物原理一、概述随着生物技术的发展，载体结构设计在基因工程研究中扮演着至关重要的角色。

其中，酶切位点和引物的设计原理对于基因克隆、表达及遗传转化等方面均有重要意义。

本文将从酶切位点和引物的原理出发，探讨载体结构设计的相关内容。

二、酶切位点的设计原理1. 基本概念酶切位点是指DNA序列上特定的核苷酸序列，能够被特定的限制性内切酶识别并切割。

通过合理设计酶切位点，可以实现对DNA序列的特异性切割，为后续的基因工程操作提供必要的前提条件。

2. 设计原则（1）选择适当的限制性内切酶酶切位点的选择应基于限制性内切酶的特异性，并考虑到后续的克隆和操作需求。

通常选择常用的限制性内切酶，如EcoRI、BamHI等。

（2）避免酶切位点的相互重叠在设计酶切位点时，应当避免酶切位点之间的相互重叠，以免出现无法正常切割的情况。

还应考虑酶切位点的相对位置，以保证后续的克隆操作能够顺利进行。

（3）考虑DNA序列的完整性在设计酶切位点时，应当考虑到DNA序列的完整性，避免对基因序列造成不必要的破坏。

还需注意酶切位点的分布情况，以减少对DNA序列的干扰。

3. 应用示例以人类胰岛素基因为例，其序列包含多个酶切位点，如EcoRI和BamHI。

通过合理设计酶切位点，可以实现对人类胰岛素基因的特异性切割，为后续的基因工程操作奠定了基础。

三、引物的设计原理1. 基本概念引物是用于PCR扩增、基因克隆等实验操作中的一种寡核苷酸片段。

合理设计的引物能够与目标DNA序列特异性结合，从而实现对目标序列的扩增和克隆。

2. 设计原则（1）选择合适的引物长度引物的长度应控制在15-30个核苷酸之间，过长或过短的引物容易导致PCR扩增效率低下。

（2）避免引物间的相互作用在引物的设计中，需要避免引物之间的相互作用，以免出现不必要的二聚体或引物假扩增。

（3）考虑引物的特异性引物的设计应基于目标DNA序列的特异性，避免引物与非目标序列结合，从而影响后续实验结果的准确性。

常用载体构建说明书步骤：一、基本耗材准备（抗生素、LB液体培养基、LB固体培养基、离心管、枪头、三角瓶）二、制备感受态大肠杆菌三、设计引物四、Pcr扩增五、Pcr产物检测六、Pcr产物回收七、双酶切pcr产物和质粒八、酶切产物回收九、目的基因与载体连接十、转化感受态大肠杆菌十一、单克隆检测十二、测序比对十三、提质粒十四、酶切验证十五、转化感受态农杆菌十六、单克隆检测十七、侵染液配制一、基本耗材准备1、抗生素的制备（抗生素为索来宝公司）常用抗生素Kan（卡那）Amp（氨苄）Rif（利福平）母液浓度：Kan 50mg/ml Amp 100 mg/ml Rif 100 mg/ml工作浓度：Kan 50ng/ul Amp 100 ng/ul Rif 100 ng/ul举例：称取kan固体1g 于注射器中，加入20ml ddH2O，溶解后用过滤器注入灭过菌的离心管中，-20度保存，使用比例1:1000注意：Rif溶解时加入DMSO2、培养基的配制LB液体培养基1000ml 200ml牛肉膏5g 1g蛋白胨10g 2g氯化钠10g 2gLB固体培养基1000ml 200ml牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂粉5g10g10g15g1g2g2g3g120℃高温高压灭菌15-20min，固体培养基冷却后加入相应抗性，加入比例1:1000，然后把培养基倒90cc的培养皿中，一般情况下一个培养皿可倒20ml培养基。

3、离心管、枪头、三角瓶0.2ml、1.5ml、2.0ml离心管各200-500个，50ml离心管2个10ul、200ul、1000ul 枪头各2盒50ml、100ml、250ml 、500ml三角瓶各2个去离子水或双蒸水500ml二、制备感受态大肠杆菌（所用超级感受态细胞制备试剂盒购于上海生工）BT Media 培养基制备：1支BT Media加50 ml蒸馏水配制，放入250ml三角瓶，高压灭菌即可准备工作：将BT Buffer A和BT Buffer B 放冰上遇冷，遇冷低温离心机至4℃1、用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线，置37℃培养箱中静置培养12-16h待菌落生长到1-2mm大小。

引物设计原则（汇总）普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）：1. 普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性；2. 下载基因序列到Vector NTI；3. 找到所需安装载体序列；4. 将基因序列的CDS高亮标记；5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。

酶切位点一般是6bp的回文序列；6. 从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp 补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；7. 将上游酶切位点序列补在ATG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。

注意，所有的补齐不能用到终止密码子；8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码；9. 从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；10. 选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。

不过重复的序列也不能太多，以免移码；11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。

不过重复的序列也不能太多，以免移码；12. 最后在NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。

载体双酶切位点选择
双酶切位点选择是在分子生物学和基因工程中非常重要的步骤，它涉及到选择合适的酶切位点来进行DNA片段的定向切割。

在选择
双酶切位点时，需要考虑以下几个方面：
1. DNA序列特征，首先需要分析目标DNA序列的碱基组成、长度、重复序列等特征。

这些特征会影响双酶切位点的选择，比如重
复序列可能会导致酶切位点不唯一，碱基组成可能会影响酶的识别
和切割。

2. 酶切位点的位置，选择的双酶切位点应该位于目标DNA序列
中较为容易获取的区域，比如没有太多的限制性位点或者结构域。

同时，需要考虑酶切位点与目标序列两端的距离，以确保切割后的
片段长度符合实验要求。

3. 酶切位点的互补性，如果需要在同一DNA分子上进行多次酶切，就需要选择具有互补性的酶切位点，以避免相互影响或者无法
进行切割的情况。

4. 其他实验条件，在选择双酶切位点时，还需要考虑实验条件，
比如反应缓冲液的适应性、酶的活性和特异性等因素。

综合考虑以上几点，可以利用生物信息学工具对目标DNA序列进行分析，寻找适合的双酶切位点。

此外，还可以进行体外酶切实验来验证选择的酶切位点是否符合实验要求。

在实际操作中，需要谨慎选择双酶切位点，以确保实验的顺利进行和结果的准确性。

酶切注意事项1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。

因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端⾄少保留有若⼲个碱基才能保证酶的有效切割。

有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。

2、回收PCR产物：回收的PCR产物⽚段=1：10　，⼀般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为?g 单位的 DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分⼦量）所得数值即为?g,也可以直接⽤这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66µg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。

3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多⼈建议酶切过夜，其实完全没有必要，⼀般酶切3个⼩时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。

酶切体系不宜过⼤，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最⼤量，否则酶切不完全，酶的⽤量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解 1ugDNA。

4、两种酶切的条件不同时，分别进⾏两次酶切，切完⼀个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切⾼温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切⾼盐浓度要求的。

5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因⼦螯合，影响酶切效果，可放⼤酶切体积或重新浓缩质粒。

6、限制酶的选择⾮常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率⾼的限制酶，提前看好各公司的双切酶所⽤公⽤的BUFFER，以及各酶在公⽤BUFFER⾥的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶⼿法不准，很容易割下⼤块的胶，影响纯化效率。

酶切位点的设计（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。

Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。

不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。

所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。

Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。

简单的计算公式可以用2+4的公式。

若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。

克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。

但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。

有研究者使用了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。

结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。

一般来讲，在酶切位点前加入两个GC碱基，因为如果保护碱基为AT的话,保护碱基在PCR产物的末端,AT之间只有两个氢键,结合力差,容易在末端产生单链,这样的话限制性内切酶就无法作用。

其实加保护碱基的多少，是具体情况具体讨论，比如HindIII、BamHI等就得有三个保护碱基。

少了一个就无法切动。

保护碱基的作用限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。

3）选择载体。

根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。

如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。

2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。

3）4℃，12000rpm离心10min。

4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。