核酸体外扩增技术综述

PCR技术综述08检二陈勇0803010049PCR技术综述聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。

能通过体外（试管内）扩增将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。

目前，这项已广泛应用于分子生物学的各个领域，在医学检验中也显示广阔的应用前景。

PCR技术的展简史1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。

1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。

1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。

其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow 片段。

但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。

这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。

但每循环一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。

此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。

由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。

为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。

PCR扩增PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。

使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。

PCR技术常与其他技术结合起来使用，如RT-PCR、竞争PCR、槽式P CR、RAPf)、ARDRA等。

RT-PCR不仅能检测出不能培养微生物，还能测量mRNA基因的转录水平。

竞争性PCR是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。

将PCR技术和限制酶切技术结合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR扩增产物，通过对酶切产物的分析，探测该基因的多态性。

RAPD(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)也是应用比较广泛的一项技术。

RAPD是用那些对某—特定基因的非特异性的引物来扩增某些片段。

RAPD分析用于探测含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性。

用RAPD分析所得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试规模和中试规模的反应器方面是有用的，但还不足以用来估测群落的生物多样性。

PCR反应常见问题汇总1.PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

2.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

核酸的体外扩增概述核酸体外扩增，也称为聚合酶链式反应（PCR），是一种重要的分子生物学技术，用于扩增和复制特定DNA或RNA序列。

PCR技术的广泛应用和成功应用于许多领域，例如基因检测、疾病诊断、法医学、基因工程等。

本文将对PCR技术进行概述。

PCR技术的原理是依靠DNA的双链结构，通过循环变性、引物结合和DNA合成三个步骤，实现对特定DNA序列的放大。

这三个步骤分别是变性步骤、退火步骤和延伸步骤。

变性步骤：PCR反应开始时，DNA双链被加热至95°C以上，使两个DNA链分离，并形成两个单链DNA（ssDNA）。

高温对DNA的作用是破坏氢键，导致核苷酸碱基对之间的结合断裂。

退火步骤：PCR反应降温至50°C-60°C，引物（primer）结合到目标DNA的末端，引物是DNA聚合酶所需要的模板以及DNA链延伸的起始点。

延伸步骤：PCR反应在60°C-75°C下进行，加入了一种DNA聚合酶，如热稳定的Taq聚合酶。

该酶识别引物，并根据引物上的信息开始合成新的DNA链。

在延伸步骤中，引物结合到目标DNA的3'末端，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链，通过碱基配对法则，以模板链作为基础合成新的互补链。

这个过程重复多次，每次延伸都以新合成的DNA链的3'末端为起始点，最终在特定的PCR循环中产生大量的复制DNA。

PCR技术可分为传统PCR和实时定量PCR两种方法。

传统PCR是利用热循环PCR仪进行多个PCR循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。

由于PCR是在反应管中进行的，所以扩增产物只能通过凝胶电泳进行检测，不能实时监测。

实时定量PCR是在PCR反应中添加一种荧光信标，通过检测荧光信号的强度来实时监测扩增过程。

实时定量PCR具有高效、快速、准确的优点，能够定量测量样本中起始模板的数量。

同时，实时定量PCR还具有多样性，可用于各种样品，包括基因型分析、基因表达分析、病原体检测等。

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目的的获取及体外扩增技术概述在基因的研究及体外人工复制过程中，我们通常把需要研究的基因称为目的基因。

基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题。

一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达，常用的有PCR法、cDNA法及建立基因文库等。

1.PCR法技术及原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。

它是一种体外酶促合成，扩增特定 DNA片段的方法。

1985年由美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。

随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。

PCR技术模拟DNA的天然复制过程，基于DNA的半保留复制原理，其特异性依赖于与靶两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3个基本反应过程：变性——退火——延伸。

变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热至93℃左右，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。

退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性（称为退火）。

在此过程中，引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。

延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。

经重复循环变性——退火——延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

核酸体外扩增技术研究进展摘要体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。

核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。

随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。

就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。

关键词核酸体外扩增聚合酶链式反应（PCR）等温扩增核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。

核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。

核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。

核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，蛋白质是生命活动的表达物质，基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序列，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。

而在1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，直到现在，体外核酸扩增技术仍然在不断地改进和完善，新的核酸扩增模式也不断涌现[1]。

一、聚合酶链式反应(PCR)PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面[2]。

聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。

近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。

已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。