保健用品微生物检验方法 第3部分：铜绿假单胞菌测定警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。
本标准并未指出所有可能的安全问题。
使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。
1 范围本标准规定了保健用品中微生物中铜绿假单胞菌的测定方法。
本标准适用于生产和经营的保健用品中的铜绿假单胞菌测定。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。
此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42 ℃±1 ℃条件下能生长。
4 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯 。
实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。
4.1 灭菌生理盐水:详见附录A.1。
4.2 灭菌液体石蜡:详见附录A.2。
4.3 灭菌吐温-80:详见附录A.3。
4.4 SCDLP:详见附录A.4。
4.5 十六烷基三甲基溴化铵:详见附录A.5。
4.6 乙酰胺:详见附录A.6。
4.7 革兰氏染液:详见附录A.7。
4.8 绿脓菌素测定培养基:详见附录A.8。
4.9 硝酸盐蛋白胨水:详见附录A.9。
4.10 明胶液化培养基:详见附录A.10。
5 仪器和设备5.1 天平：感量0.1 g。
5.2 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。
5.3 高压灭菌器。
5.4 量筒：100 mL、200 mL、2000 mL。
5.5 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。
5.6 无菌锥形瓶：100 mL、200 mL、250 mL、2000 mL。
5.7 研钵。
5.8 振荡器。
5.9 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃、28 ℃±2 ℃。
5.10 接种针、接种环。
5.11 显微镜。
5.12 小倒管。
5.13 玻璃棒。
5.14 冰箱：2 ℃～5 ℃。
6 样品6.1 样品的采集所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应从不少于2 个包装单位的取样中共取10 g(5.1)或10 mL(5.2)。
包装量小于20 g的样品，采样时可适量增加样品包装数量。
6.2 注意事项6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。
6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌(5.3)，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。
6.2.5 如检出铜绿假单胞菌，自报告发出之日起该菌种应保存一个月。
6.3 样品的制备6.3.1 液体样品水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水（4.1）中，混匀后，制成1:10匀液。
油性液体样品，取样品10 g，先加5 mL 灭菌液体石蜡（4.2）混匀，再加10 mL灭菌的吐温-80，在 40 ℃～44 ℃水浴中（5.5）振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL（在40 ℃～44 ℃水浴中预温），在40 ℃～44 ℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。
6.3.2 膏、霜、乳剂半固体状样品亲水性的样品，称取10 g，加到装有玻璃珠及90 mL灭菌生理盐水的三角烧瓶（5.6）中，充分振荡混匀，静置15 min，用其上清液作为1:10的匀液。
疏水性样品，称取10 g，放到灭菌的研钵（5.7）中，加10 mL 灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状再加入10 mL灭菌吐温-80，研磨待溶解后，加70 mL 灭菌生理盐水，在40 ℃～44 ℃水浴中充分混合，制成 1:10匀液。
6.3.3 固体样品称取10 g，加到90 mL 灭菌生理盐水中，充分振荡（5.8）混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1:10的匀液。
6.3.4 膜状样品取10 cm2，将膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加100 mL生理盐水，使成10 mL/cm2 浓度，浸泡10 min 到15 min，摇匀即得。
6.3.5 含抑菌成分检验样品的制备6.3.5.1 稀释法:用稀释液和培养基将样品稀释到一定浓度，使其抑菌成分的浓度减少到无菌作用的浓度，再进行检验。
6.3.5.2 中和法:在检验样品或培养基中加入吐温-80和卵磷脂作为中和剂，以中和其抑菌效果。
6.3.5.3 对吸水膨胀或粘度大的样品，可制成1:20样液。
7 试验步骤7.1 培养7.1.1 增菌培养取1:10样品稀释液10 mL（5.4）加到90 mL SCDLP（5.4）液体培养基中，置36 ℃±1 ℃培养（5.9）18 h～24 h。
如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
7.1.2 分离培养取阳性对照菌株，同时从培养液的薄膜处挑取的培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36 ℃±1 ℃培养（5.9）18 h～24 h。
凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。
在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，放36 ℃±1 ℃培养（5.9）24 h±2 h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基呈红色，其它菌不生长。
7.2 染色镜检挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检（5.11）为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
7.3 生化试验7.3.1 氧化酶试验取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15 s～30 s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。
7.3.2 绿脓菌素试验取可疑菌落2 个～3 个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置36 ℃±1 ℃培养（5.9）24 h±2 h，加入氯仿3 mL～5 mL（5.2），充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1 mol/L的盐酸1 mL（5.2）左右，振荡后，静置片刻。
如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。
7.3.3 硝酸盐还原产气试验挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置36 ℃±1 ℃ 培养（5.9）24 h ±2 h，观察结果。
凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管（5.12）中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
7.3.4 明胶液化试验取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36 ℃±1 ℃ 培养24 h±2 h，取出放置于4 ℃±2 ℃ 冰箱（5.14）10 min～30 min，如仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。
7.3.5 42 ℃生长试验挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在42 ℃±1 ℃培养箱（5.9）中，培养24 h～48 h，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
8 试验数据处理被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42 ℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。
9 防止污染措施应按照GB 19489的规定执行。
附 录 A（规范性附录）试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
A.1 生理盐水A.1.1 成分氯化钠 8.5 g蒸馏水 1000 mLA.1.2 制法溶解后，分装10 mL 管后，121 ℃高压灭菌20 min。
A.2 灭菌液体石蜡取液体石蜡50 mL，121 ℃高压灭菌20 min。
A.3 灭菌吐温-80取吐温-80 50 mL，121 ℃高压灭菌20 min。
A.4 SCDLPA.4.1 成分酪蛋白胨 17 g大豆蛋白胨 3 g氯化钠 5 g磷酸氢二钾 2.5 g葡萄糖 2.5 g卵磷脂 1 g吐温-80 7 g蒸馏水 1000 mLA.4.2 制法先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调节pH为7.2～7.3分装，121 ℃高压灭菌20 min。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温-80充分混合，冷却至25 ℃左右使用。
A.5 十六烷基三甲基溴化铵。
