2 文库定量流程-KAPA Library Quantifcation Kit

KAPA 文库定量试剂盒说明书1. 产品说明：文库精确的定量对于二代测序的结果是非常重要的，过低估计文库的大小，导致clusters 或多重模板太多，数据质量不高，过高估计文库的大小，导致数据读取量少，基因组覆盖率低，所以低估或者高估文库的量都会影响测序效果。

qPCR 是DNA 文库定量的金标准，也是唯一一种能够准确检测出分子数目的方法。

KAPA 文库定量试剂盒包含6个10倍稀释的DNA 标准品，10×Primer Premix ，搭配有KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒，十分准确的确定文库的分子数目。

DNA 标准品片段长度为452bp ，两端包含定量引物的结合位点。

通过标准曲线计算得到定量结果。

基于qPCR 方法的文库定量主要取决于三个因素：① 准确、重现性非常好的标准品的使用；② 用于qPCR 的DNA 聚合酶有较高的扩增效率，且扩增效率均衡；③重复性好。

KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒具有高性能、高通量、实时定量PCR 等特点。

该试剂盒包含一种基因工程酶，耐受SYBR Green Ⅰ染料的抑制作用，KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒是文库定量的理想产品，该试剂盒也适用于扩增高AT 、GC 以及1kb 以上的片段。

2. 应用：KAPA Illumina GA 文库定量试剂盒是用于文库定量的理想产品： ⏹ 定量引物序列：Primer P 1: 5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’ Primer P 2: 5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’ ⏹ 浓度范围广；⏹ 包含高GC 含量的片段； ⏹ 扩增片段长度：50~1000bp 。

3. 操作流程：1) 将1ml Primer Premix 与5ml 的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2×）充分混合； 2) 制备好的DNA 文库稀释3个梯度，即：1:2000、1:4000、1:8000； 3) qPCR 反应体系：试剂加入量 引物与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 的混合物 12μl ddH2O4μl 稀释的DNA 文库及标准品（1~6） 4μl 总体积20μl*也适用于10μl 体系，引物与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 的混合物加6μl ，模板加4μl 。

定量分析的一般步骤第二章分析试样的采取和预处理方法教学要求：1、掌握定量分析的一般步骤；2、掌握试样采取得一般原则、无机和有机试样的分解方法；3、了解试样的制备和保存方法试样的分析过程，一般包括下列步骤：试样的采取和制备、试样的预处理、干扰组分的掩蔽和分离、定量测定、分析结果的计算和评价。

§2-1 分析试样的采取和制备试样采取得重要性和意义：分析试样的采集: 指从大批物料中采取少量样本作为原始试样，所采试样应具有高度的代表性，采取的试样的组成能代表全部物料的平均组成，否则分析结果再准确也是毫无意义的。

一、采取试样的一般原则1、现场勘察并收集资料；2、代表性；3、采用量符合要求；4、合理保存二、固体试样的采取（一）矿石试样1、采样点的布设（汽车、火车、轮船、矿堆、传送带等）2、湿存水的去除（100-105o C烘干）3、制备制备试样分为破碎，过筛，混匀和缩分四个步骤。

粗碎（过4-6号筛）、缩分、中碎（过20号筛）、缩分、碾磨、缩分、分析试样。

大块矿样先用压碎机破碎成小的颗粒，再进行缩分。

常用的缩分方法为“四分法”，将试样粉碎之后混合均匀，堆成锥形，然后略为压平，通过中心分为四等分把任何相对的两份弃去，其余相对的两份收集在一起混匀，这样试样便缩减了一半，称为缩分一次。

每次缩分后的最低重量也应符合采样公式的要求。

如果缩分后试样的重量大于按计算公式算得的重量较多，则可连续进行缩分直至所剩试样稍大于或等于最低重量为止。

然后再进行粉碎、缩分，最后制成100-300克左右的分析试样，装入瓶中，贴上标签供分析之用。

通常试样的取样量可按下面的经验公式(亦称采样公式)计算：m ＝ Kd a式中：m为采取拭样的最低重量(公斤)；d为试样中最大颗粒的直径(毫米)；K和a为经验常数，可由实验求得，通常K值在0.02-1之间，a 值在1.8—2.5之间。

地质部门规定a值为2，则上式为：m＝Kd2筛号(网目) 20 40 60 80 100 120 200筛孔大小/mm 0.83 0.42 0.25 0.177 0.149 0.125 0.074一般要求通过100-200目筛。

kapa library quantification kit 标准品浓度-概述说明以及解释1.引言1.1 概述引言部分是任何文章的开端，它为读者提供了对整篇文章的整体认识。

在本篇文章中，我们将深入探讨kapa library quantification kit标准品浓度的相关内容。

kapa library quantification kit是一种用于测量DNA 浓度的工具，它具有高灵敏度和准确性，被广泛应用于生物学研究和实验室工作中。

在本文中，我们将重点介绍kapa library quantification kit的原理和使用方法，以及如何通过标准品来确保测量结果的准确性。

标准品浓度的正确测量对于实验结果的可靠性至关重要，因此我们将深入讨论标准品浓度的重要性以及如何进行准确的测量。

最后，我们将探讨kapa library quantification kit在不同应用场景下的具体应用方法。

通过本文的阅读，读者将了解kapa library quantification kit及标准品浓度的重要性和使用方法，希望本文能为相关实验工作者提供有益的参考和指导。

1.2 文章结构文章结构部分将介绍本文的整体框架和各部分内容的安排。

首先将简要介绍引言部分，概述文章主题和目的。

然后将详细解释正文部分，包括对kapa library quantification kit和标准品浓度的介绍以及它们在实际应用中的场景。

最后将总结全文，展望未来研究方向，以及给出一些结束语。

通过这样清晰的结构安排，读者将更容易理解本文的内容和研究意义。

1.3 目的:本文的目的是介绍kapa library quantification kit 标准品的浓度，为读者提供关于该产品的详细资料和应用指导。

通过对该标准品浓度的介绍，读者可以更好地了解如何正确使用该试剂盒进行库定量，从而提高测序实验的准确性和可靠性。

同时，本文还旨在帮助读者了解该产品的应用场景，为其科研工作提供参考和指导。

A Step-by-Step Guide to Setting up sparQ Fast Library Quant RunFiles Without a TemplateIntroductionTemplate files provide the Q software information about assay and run parameters. Two template files for use with the sparQ Fast Library Quant Kit, for 10 µl or 20 µl reactions, are available for download from the Quantabio website. These are pre-configured with the cycling protocol and information about locations of the six sparQ DNA standards included as triplicate reactions in the run.The purpose of this document is to provide guidance on how to manually set up the assay and run files for customers who require more flexibility regarding the number of replicates, the positions of the sparQ DNA standards, or the cycling parameters.Assay Setup1.Open the Q software.2.Select the New icon and then select Assay.3.Under the Information tab, fill in the box titled Name with ‘sparQ Fast Quant’.The box titledDescription is optional and does not require any input but can be useful to provide further information about the target and experiment. Make sure the Chemistry Type is set to Intercalating Dye and Dye is ‘SYBR®Green’.4.Under the Profile tab, set the following parameters for our recommended cycling conditions*:(* for maximum flexibility, customers can choose to adjust any of these settings)a)In the Activation panel, set Activation to 95°C for 2:00 (min:sec).b)In the Cycling panel, delete the 72°C step to make it a 2-step reaction. Set the number ofcycles to 35, configure step 1 as 95°C for 5 sec (s), and configure step 2 as 65°C for 25 s.Make sure the camera icon is highlighted in Step 2 to acquire data at this temperature fromthe green channel.c)Optional melt step: In the Melt panel, ensure the parameters are set as below:d)In the Profile panel, set the Temperature Control pull down to ‘Fast TAQ (v3) and set theVolume to the desired volume.5.Defining the Analysis settings.a)Left-click the ‘+’ icon next to the Analysis title and from the dropdown menu select Cycling.b)Once the Cycling analysis is created, select ‘sparQ Fast Quant’ and ensure the parameters areset as in the next figure.c)If the optional melt step is included in the run profile, create the Melt analysis by left-clickingthe ‘+’ icon next to the Analysis title and from the dropdown menu select Melt.d)Once the Melt analysis is created, select ‘sparQ Fast Quant’ and ensure the parameters areset as in the figure below.e)Create the Absolute Quantification analysis by left-clicking the ‘+’ icon next to the Analysistitle and from the dropdown menu select Absolute Quantification. Ensure the parameters areas below:6.Save the assay by clicking the Save icon at the top of the screen and provide a descriptive name to thefile such as ‘sparQ Fast Quant Assay –Custom’. The software will automatically save the assay to the default location that is created during software installation C: Libraries/Documents/Quantabio/Q-qPCR/Assays.Run Setup1.Select the New icon then select Run.2.Add the assay to the run by selecting the ‘+’ icon beside the Assays tab. A dropdown menu will appearwith available assays saved to the default location. Select the newly-created assay, in our example ‘sparQ Fast Quant Assay –Custom’.Sample Editor1.The next step is to complete the sample editor setup. Left-click on the Samples option in the navigationbar.2.Enter the names of the unknown NGS libraries to be measured or the sparQ DNA standards in the[Name]column. The sample rows must match the positions of the reactions in the Q rack and corresponding rotor positions. Row indicators can be toggled between numeric only or alpha-numeric using the icons at the top of the sample editor.3.All sparQ DNA Standards should be assigned as ‘Standard’by clicking in the [Type]column andchoosing from the dropdown menu. Library samples to be measured should be kept as ‘Unknown’.Any no template control reactions included in the run should be assigned as ‘NTC’.4.All sparQ DNA Standards must have the concentrations defined in the sample editor. In the [StandardsConcentration] column, click on the copies/µl and replace by typing ‘picomolar’ or ‘pM’.5.Enter the concentrations for each of the sparQ DNA Standards according to the values in the chartbelow.Save the Run File and Start the Run1.Once all settings and samples are entered, click the [Save] icon at the top of the screen. This will triggera pop-up window where the run file is assigned a name and designated folder location.2.Load the capped sample tubes into the appropriate positions in the Q rotor by matching the markingson the loading rack with the markings on the rotor. Place the tube clamp on top of the rotor and close the lid of the Q.3.Click on the instrument icon near the top right corner of the Q qPCR software window and choose[Start Run].sFor guidelines on data analysis, please refer to our related document –A Step-by-step Guide to Analysis of sparQ Fast Library Quantification Data.。

本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==定量实验步骤篇一：实时荧光定量PCR具体实验步骤实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下1201Xrpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下1201Xrpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。

样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

文献定量分析法-详解目录• 1 什么是文献定量分析法• 2 文献定量分析法的程序和基本方法什么是文献定量分析法文献定量分析法是指对各种文献的明显内容进行客观的,系统的和定量的描述.所谓“明显内容”是指各种文献外在的,表面的内容,而不是它们的内在含义.“进行客观的,系统的描述”是说文献定量分析要求研究者根据预先设定的计划,采取一定的步骤对文献内容进行如实的描述.而“定量的”描述是说明这种分析方法的基本性质是定量,它的作用通常在于明确文献内容中某一问题出现的频率,或者决定某一类别在整个内容中所占的比例等等。

文献定量分析法的程序和基本方法（1）抽样定量分析从样本抽样开始。

抽样的对象不仅仅是文献摘录，而是把所有可搜集到的有关文献作为总体。

抽样可采用各种方法，较常用的是简单随机抽样和分类（分层）抽样和分阶段抽样方法。

一般首先是名称抽样，例如从所有报刊杂志或电视台中抽取若干种。

其次是单位抽样，例如从所抽报刊杂志的所有期号中抽取若干期号，从所抽电视台的所有时段中抽取若干时段。

最后是内容抽样，例如从所抽期号或时段中抽取某些方面的内容，形成最终样本。

另外，各种形式的文献也都可以在时间、地点、规模、颜色、频率等其他概念层次上进行抽样。

（2）确定记录单位记录单位亦称文献观察单位，是具体记录的计量单位。

文献的主题、项目、人物、词组、概念、句子、段落等都可以作为记录单位。

（3）编录编录就是为所确定的各个记录单位制定或赋予数字符号（数值），并将这些数值按一定顺序排列，制成编录单，以便于量化分析和统计。

（4）计量在记录单位确定和编码完成后，就可以进入定量分析最重要的分析环节了。

分析的方法主要有四种：1、计词法计词法是最简单、最常用的方法，主要用于以单词、主题、类型为记录单位的情况。

具体作法是统计这些单词或代表主题、类型的关键词在各个样本中出现的频数和比例，然后进行比较。

2、概念组分析法它是将与分析内容有关的关键词分成小组，每组代表一个概念，同时也是理论假设中的一个变量。