半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

凝胶半定量试验的试验原理凝胶半定量试验是一种常用的分子生物学技术，用于定量测定RNA或DNA在样品中的相对丰度。

该试验基于凝胶电泳原理，通过将待测样品与已知浓度的标准品一同加电泳，然后根据标准品的浓度与带状的相对强度关系，推断出待测样品中RNA或DNA的相对丰度。

凝胶半定量试验的步骤通常包括：DNA或RNA的提取、体积标准化、RT-PCR （逆转录-聚合酶链式反应）扩增和凝胶电泳分析。

下面我将详细介绍凝胶半定量试验的原理及每个步骤的具体操作。

1. DNA或RNA的提取：首先需要从样品中提取待测的DNA或RNA。

这一步骤通常使用化学方法或商用的提取试剂盒完成。

提取的目的是将待测物质与其他的杂质分离，并纯化待测物质，以便后续的定量分析。

2. 体积标准化：将提取的DNA或RNA用无菌的RNase-free水或TE缓冲液进行标准化稀释，使其体积一致。

通过标准化处理，可以确保每个待测样品都包含相同体积的DNA 或RNA，便于后续的分析和比较。

3. RT-PCR扩增：反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种将RNA转录成cDNA，并通过聚合酶链式反应扩增cDNA的技术。

在该步骤中，首先利用逆转录酶将RNA转录成相应的cDNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增。

4. 凝胶电泳分析：将扩增后的产物进行凝胶电泳分析。

准备好醋酸盐缓冲液和琼脂糖凝胶，将样品加载到凝胶孔中，施加一定的电场后进行电泳。

通过电泳，待测样品和标准样品中的RNA或DNA会根据其大小和电荷的不同在凝胶中迁移。

迁移的速度与RNA或DNA的相对浓度有一定的关系。

在凝胶电泳结束后，将凝胶进行染色，常用的染色剂有乙溴化乙锭（EtBr）或SYBR Green等。

之后，使用紫外线或激光扫描仪对凝胶进行成像，并通过软件进行图像分析。

根据标准品的带状强度与浓度之间的关系曲线，可以推断出待测样品中RNA或DNA的相对丰度。

一般情况下，使用光密度或荧光强度作为反应的强度指标，通过软件测定各个待测样品的带状强度，并与标准品的曲线进行比较，从而确定待测样品中RNA或DNA的相对丰度。

标准终点RTPCR实时荧光定量PCR（real-time PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、遗传疾病诊断等领域。

在实时荧光定量PCR技术中，终点PCR是一种常用的PCR方法，它可以通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。

本文将介绍标准终点RTPCR的原理、方法和应用。

1. 原理。

标准终点RTPCR是一种半定量PCR技术，其原理是利用DNA或RNA模板，在PCR反应体系中进行多轮扩增，通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。

在PCR反应中，每一轮循环都会产生指数级增加的DNA或RNA产物，同时伴随着荧光信号的累积。

当PCR反应达到饱和时，荧光信号会呈指数级增加，最终趋于平稳。

通过检测PCR反应终点的荧光信号强度，可以确定起始模板的含量，从而实现对目标DNA或RNA的定量分析。

2. 方法。

标准终点RTPCR的方法包括PCR反应体系的准备、PCR程序的设置、荧光信号的检测和数据分析等步骤。

首先，需要准备PCR反应体系，包括模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶等。

然后，设置PCR程序，包括预变性、PCR扩增和荧光信号采集等步骤。

在PCR扩增过程中，荧光信号会随着PCR产物的累积而增加，直至达到饱和。

最后，通过荧光检测仪器采集PCR反应终点的荧光信号，并进行数据分析，得出目标DNA或RNA的定量结果。

3. 应用。

标准终点RTPCR技术在科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。

在基因表达分析中，可以利用标准终点RTPCR技术对特定基因的表达水平进行定量分析，从而揭示基因调控网络和信号转导通路。

在病原微生物检测中，可以利用标准终点RTPCR技术对病原微生物的核酸进行定量检测，实现对病原微生物的快速、准确的诊断。

在遗传疾病诊断中，可以利用标准终点RTPCR技术对患者的遗传物质进行定量分析，为临床诊断和治疗提供依据。

RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。

原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。

因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。

在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。

尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。

GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。

c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。

RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。

下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。

步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。

常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。

2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。

逆转录反应需要逆转录酶和引物。

在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。

3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。

退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。

4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。

PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。

PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。

5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。

注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。

为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。

2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。

阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。

质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。

3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。

引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。

此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。

4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。

反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。

1 半定量RT－PCR 方法的检测步骤1. 1 提取组织或细胞中的总RNA总RNA 的纯度和完整性关系到后面的cDNA合成及PCR 扩增, 因此所提的总RNA 要求纯度高,完整性好并达到一定的浓度. 要达到这一要求, 必须从取标本开始就进行无RNA 酶操作, 以防RNA 酶对所提总RNA 的降解, 具体做法为: 所用的器械及器皿必须经200 ℃以上的高温烘烤最少5 h; 所用的耗材及试剂必须用0. 1% 的DEPC 水处理12～ 16 h,这样方可保证所提总RNA 的完整; 在选用试剂时最好选用知名品牌公司的试剂, 以保证总RNA 纯度及提取的产量; 另外所用的组织量最少应在100mg、细胞数最少应在107.1. 2 总RNA 的纯度和完整性鉴定总RNA 提取之后, 必须用紫外分光光度计测定其纯度和浓度,A 260?A 280 在1. 8～ 2. 0 之间方可采用; 然后再用1. 5% 左右的琼脂糖凝胶对总RNA 进行电泳, 以鉴定其完整性, 浓度不高, 完整性不好的标本最好不用, 以免影响后面的实验结果.1. 3 cDNA 第一链的合成由总RNA 逆转录成cDNA 时, 所取的各组标本的总RNA 的量必须要一样多, 最好在1ug 以上, 这样才能保证各组标本总RNA 中所需检测的mRNA量的差异.为了使逆转录效益最大, 最好采用含有多个碱基的随机序列引物.1. 4 PCR 扩增以逆转录的cDNA 第一链为模板, 以特异性引物扩增所要检测的mRNA. 在PCR扩增时一定要注意以下两点: ①为了克服不同管间扩增引起的“管效益”, 必须以组成型表达的内参基因如β-actin (或其它的看家基因, 如GA PDH、β-M G 等) 为内标, 在同一管中加入扩增内参基因的引物, 共同扩增所要检测的基因和内参基因, 内参扩增产物的大小最好与目的基因mRNA 扩增产物的大小相差200 bp 以上,这样便于观测结果; ②由于PCR 扩增存在着扩增效率及平台期的问题, 因此必须进行预试验以确定待检测基因与内参基因达到平台期前扩增效率最大的循环数. 对于PCR 反应存在着这样的关系式: N =N 0 (1+ E) n. 其中N 0为起始浓度, E 为扩增效率, n代表扩增周期,N 为产物最终浓度. 那么log N = nlog (1+ E) + log N 0. 通过预试验, 在不同的周期取样进行密度扫描, 以待检测基因与内标比值的对数分别与扩增周期作图, 如在20～ 30 周期内, 它们的线性关系良好, 说明在30 周期内二者的扩增未到达平台期, 最后确定扩增效率最大的循环数, 这样可有效地避免因引物结合效率不同而引起的误差.1. 5 结果的分析根据扩增产物片段的大小配制最适宜浓度的凝胶, 将PCR 扩增产物进行电泳.待检基因与内参基因的扩增条带应相隔一定的距离(最少200 bp 以上) , 以便于观测结果及密度扫描, 且所选用的Marker 应尽量含有与扩增产物相对应的条带. 电泳条带经密度扫描仪扫描, 得到待测基因与内参基因条带各自的峰面积积分值, 计算各组样品两者的比值. 为了使扩增条带密度扫描的峰面积积分值尽量的准确可靠, 电泳条带一定要清晰, 不能有杂带出现. 有杂带出现的标本最好不用, 若有杂带应重新调整PCR 过程中的退火温度, 直至杂带消失, 这样才能保证扫描结果的专一性及可靠性.2 半定量RT -PCR技术的关键因素2. 1 总RNA 和cDNA 的质量只有在总RNA 未被降解的情况下, 才能保证其中mRNA 的完整性和随后反转录的cDNA 的质量,从而真实反映基因的表达.2. 2 总RNA 的定量在反转录之前, 作为起始模板各个样品中的总RNA 量要一样, cDNA 量和电泳PCR 产物量也要一样, 这样才能保证PCR 扩增产物能真实反映基因表达的实际情况.2. 3 引物的选择PCR反应的特异性是由一对上下游引物所决定的, 因此引物的好坏往往是PCR 反应成败的关键. 引物包括扩增目的基因的引物及扩增内参基因的引物, 引物的设计, 要根据基因的非保守序列设计, 以保证扩增的特异性.2. 4 PCR 循环数的确定选择合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖凝胶上清晰可见和定量, 也可使扩增反应在到达平台期前的线性范围内进行.在RT-PCR 方法中, 反应的循环数是一个必须分析的参数. PCR 扩增产物的量与循环数之间有一线性关系. 前期的扩增产物量随循环数的递增而成比例增加. 随着DNA 聚合酶活性的下降和溶液中反应底物的消耗, 扩增产物将达到一个平台. 半定量分析的循环数应确定在成比例的线性关系范围内. 表达丰度不同的基因半定量分析的PCR 循环数不同.PCR 扩增反应是酶促反应, 遵循酶促反应定律, 开始的循环内扩增产物呈指数累积, 产物与模板呈线性关系, 半定量RT-PCR 技术正是利用产物与模板的这一线性关系, 通过扩增产物来对比总RNA 中目的基因的表达, 但经过一定的循环后, PCR 产物不再呈指数累积而进入平台期, 在平台期低水平表达的目的RNA 可能会增加到与高水平表达的目的RNA 相同的浓度, 因此, 为避免平台效应的影响, 合适的循环数是PCR 半定量方法的关键因素之2. 5 最佳Mg2+ 浓度的确定M g2+ 浓度对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响, 因为它是影响Taq 酶扩增效率的重要因素,除此之外,M g2+ 还可影响引物的退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等. 浓度范围多在0. 5～ 5 mmo lPL , 但扩增的效率则主要视序列而定. 在一般的PCR 反应中, 各种dNTP 浓度为200 umo lPL 时,M g2+ 浓度为1. 5～ 2. 0 mmolPL 为宜. M g2+ 浓度过高, 反应特异性降低, 出现非特异性扩增, 浓度过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性, 使反应产物减少. 实验过程中可分别取1. 0、1. 5、2. 0mmo lPLMg2+ 进行预实验, PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后, 通过鉴定其亮度和特异性, 来确定最适的M g2+ 浓度.2. 6 合适内参的选择设立内参照可以减少因RNA 定量时产生的误差, 也可消除细胞个数的差别所带来的误差. 为避免RNA 抽提、加样、测量、cDNA 合成及PCR 反应过程中的某些系统误差和人为误差, 实验要选用在生物体内稳定表达且在其它生理条件下不受影响或影响很小的持家基因片段作为内参.传统的半定量RT-PCR 技术多以β-act in 作内参, 另外常用的内参照还有GAPDH, 它是一种细胞内代谢酶, 其基因属于保守性强的“管家基因”, 该基因在生物体内普遍存在且稳定表达. β-M G 也是常用的内参, 研究表明18 S rRNA 具有更强的保守性和更普遍而恒定表达的特性, 因此在很多情况下也常常被用作内参. 不同的生物体其生命过程和生理过程各不相同, 选用何种内参要根据目的基因和实验的具体情况而定.3 半定量RT-PCR 法的应用半定量RT-PCR 是目前研究基因转录水平的有效手段, 可用来检测基因表达及其变化状况, 并可进行定量分析, 万平等以微管蛋白基因(Tubulin) 为对照,利用半定量RT 2PCR 法研究发现小麦锌指蛋白基因(TazF) 属于组成型表达基因. 王维平等以水稻肌动蛋白基因(Actin) 为对照, 利用半定量RT-PCR 研究, 发现水稻RCOI1基因的表达受茉莉酸甲酯(MeJA) 的诱导. 同时半定量RT 2PCR 方法在病原体检测、转基因的安全检测及肿瘤的研究方面也有非常广泛的应用.4 总结与展望半定量RT-PCR 法除了要求反转录和PCR条件完全一致外, 相比较样品之间最好同批进行RT -PCR , 对于用凝胶扫描检测PCR 扩增产物来说, 更适宜在同一块凝胶上进行电泳分离. 如果样品数量多, 由于泳道限制, 就不能同时在一块胶上电泳. 这时可采用Life Technologies 公司的定量Marker, 通过计算分析,得到PCR 扩增产物的含量, 这样就可对同批扩增的样品进行多次重复电泳检测, 以提高定量的准确性和可靠性. 另外采用反转录与PCR分开进行的两步法RT-PCR , 在实验摸索阶段较一步法RT-PCR更为经济和方便, 因为每次提取到的总RNA 立即反转录成cDNA 存放, 可以尽量避免RNA操作中的降解, 而且一次反转录的cDNA 模板可供多次PCR 使用, 不但节约成本还可缩短实验周期,提高实验成功率.若靶基因的模板量大大低于内参基因, 若按常规方法同时加入两种基因的引物进行PCR 扩增, 在同一PCR 体系中, 太高浓度的模板会竞争性地形成优势扩增, 从而使另一模板失去指数扩增. 同时, 由于PCR 扩增中“平台期”的影响, 当靶基因可用EB检测出时, 内参基因已快进入“平台期”. 因此可采用PCR 扩增时内参照引物滞后加入的方法, 使内参照与靶基因同时处于指数增长期, 这样就可避免内参的优势扩增. 另外半定量RT - PCR 检测体系必须防止混在RNA 中的基因组DNA 带来的假阳性. 为排除可能的污染, 在实验中可同时设置两个阴性对照,一是以mRNA 为模板直接进行PCR 反应, 另一组不加任何模板. 若含有基因组DNA , 则会有条带出现.总之, RT-PCR 法是讨论基因转录水平的有效手段, 利用RT 2PCR 法对mRNA 进行半定量分析,最关键的是优化实验条件, 寻求PCR 线性扩增范围, 确定最适M g2+ 浓度和PCR 循环数. 但是要使该法能够较准确地定量, 还有许多要注意的问题, 如在进行目的基因的定量分析过程中尚需考虑目的基因和内对照基因的丰度、大小以及它们的引物长短对扩增反应的影响, 另外就定量分析而言, 要使PCR产物量能够较好地反映起始模板量, 必须对处于指数扩增阶段的产物进行检测, 而它是不能通过EB 染色检测到的, 这是在利用常规PCR 方法分析目的基因表达变化过程中常遇到的难题, 大多数实验室常将定量分析过程中的PCR 扩增循环数提高到30 甚至35 个循环, 但是, 往往导致实验失败, 因此, 寻求一种高灵敏度的检测核酸数量变化的方法是今后需要努力去做的工作.。

半定量PCR的原理及其应用1. 引言半定量PCR（Semi-quantitative PCR）是一种应用广泛的分子生物学技术，用于分析特定基因在样本中的相对表达水平。

本文将介绍半定量PCR的原理和其在生命科学研究中的应用。

2. 原理半定量PCR基于定量PCR技术，但相对于定量PCR，半定量PCR并不精确地确定特定基因的绝对表达水平，而是通过对样本中目标基因和内部参照基因的PCR扩增进行比较，从而得出目标基因的相对表达水平。

半定量PCR的原理过程如下：1.样本提取：从待测样本（如细胞、组织等）中提取总RNA或DNA，并经过反转录反应获得cDNA。

2.反应设计：选择目标基因的引物和内部参照基因的引物。

内部参照基因在不同样本中的表达水平稳定，因此可作为对照。

3.PCR反应：将待测样本的cDNA和引物以及适当的PCR缓冲液、酶等加入PCR反应管中，进行PCR扩增。

4.延伸周期：利用PCR仪按照特定的温度和时间条件进行一系列的扩增周期，使目标基因和内部参照基因进行扩增。

5.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳，确定扩增产物的大小，并通过测定相对带状强度来比较目标基因和内部参照基因的表达水平。

6.数据分析：通过半定量PCR的标准曲线或内标法等方法，计算出目标基因的相对表达水平。

3. 应用半定量PCR的应用广泛，特别在以下方面具有重要作用：3.1 基因表达研究半定量PCR可用于研究不同基因在不同组织或细胞中的相对表达水平，从而了解基因的功能及其调控机制。

通过对目标基因和内部参照基因的半定量PCR分析，可以比较不同样本中目标基因的表达差异。

3.2 药物研发半定量PCR可用于药物研发过程中的药效评估。

通过比较药物处理组和对照组样本中目标基因的表达水平，可以评估药物对基因表达的影响。

3.3 疾病诊断半定量PCR在疾病诊断中具有重要的应用价值。

通过检测目标基因在患者样本中的表达水平，可以辅助诊断某些疾病，如癌症、遗传病等。

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。

样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE 中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。

本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。

同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。

引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。

反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。

一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。

这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。

反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。

反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。

RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。

引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。

二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。

PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。

PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。

PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。

每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。

变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。

三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。

凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。

半定量PCR(RT-sqPCR)半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。

以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。

这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。

步骤： 1.抽提RNA，2.反转录获得cDNA，3.以cDNA为模板做PCR 注意：步骤1，RNA抽提质量一定要好，注意污染。

内参的选择，常用的有βactin和GAPDH俩中。

步骤3，半定量RT-PCR应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！半定量RT-PCR与荧光定量Real-time PCR最大的区别就在于 semi-PCR需要跑电泳根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低而Real-Time PCR则无需电泳可以实时监测整个PCR的全程并且由给出的Ct值及Standard Curve来判断gene拷贝数的高低。

所以由上可见 semi-PCR不如Real-Time PCR精确。

至于RT 应该指 Reverse Transcription。

为了便于区分我们更偏好使用qPCR来特指 Real-Time PCR同时要注意REALTIME-PCR的定性问题，有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。

所以要利用MELTING CURVE，如果是第一次做一个目的基因的REALTIME-PCR，还是要在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定与你要扩增的目的基因大小一致。