RT-PCR的实验原理与操作步骤复习课程

RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。

原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。

因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。

在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。

尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。

GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。

c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。

RT-PCR实验原理与步骤【实验原理】RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。

【实验仪器】1. 恒温金属浴2. PCR 扩增仪【试剂及配制】RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0试剂包括：1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul)2. 10×反转录反应缓冲液3. RNAase 抑制剂(40 U/ul)4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul)5. RNAase Free dH2O6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul)7. 5×PCR 反应缓冲液8. dNTP Mixture (各10 mM)【实验步骤】1. 反转录反应1）按下列组成配制反转录反应液MgCl2 2ul2. PCR 反应1）按下列组成配制PCR 反应液2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀；3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。

4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。

【注意事项】1. PCR 条件设定退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。

延伸时间因目的序列长度不同而不同。

cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。

2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。

3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。

4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。

5. 分装试剂时务必使用新的Tip 头，防止样品间污染。

rt pcr原理RT-PCR原理RT-PCR是一种广泛应用于分子生物学和医学诊断领域的实验技术，其全称为反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）。

本文将详细介绍RT-PCR的原理。

一、反转录（Reverse Transcription）1. 反转录的概念反转录是指将RNA模板上的信息逆向转录成为DNA序列。

在RT-PCR中，反转录是制备cDNA（complementary DNA）模板的关键步骤。

cDNA是由RNA模板逆向合成的双链DNA，它可以作为PCR 扩增的模板。

2. 反转录过程反转录过程由三个主要部分组成：RNA逆向转录、RNA降解、cDNA 合成。

首先，需要使用反转录酶将RNA模板逆向转录为单链cDNA；然后通过碱基切除和填充，将单链cDNA变为双链cDNA；最后使用RNase H或其他酶降解RNA模板，得到纯净的cDNA。

二、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）1. PCR的概念聚合酶链式反应是一种体外扩增核酸序列的技术。

它可以在短时间内从微量样品中扩增出大量特定的DNA序列。

2. PCR过程PCR过程由三个主要步骤组成：变性、退火、延伸。

首先，将DNA 双链分离为两条单链，即变性；然后引入引物（primers），使其与目标序列的两端互相补合，形成一个模板-引物复合体；最后，使用DNA聚合酶在引物的作用下延伸新链。

三、RT-PCR原理1. RT-PCR的概念RT-PCR是一种结合反转录和聚合酶链式反应技术的方法，用于从RNA模板中扩增特定的DNA序列。

它可以将RNA转录为cDNA，并通过PCR扩增cDNA。

2. RT-PCR过程RT-PCR过程由四个主要步骤组成：反转录、初步扩增、二次扩增、检测。

首先进行反转录反应，将RNA逆向转录为cDNA；然后进行初步扩增，使用特定引物扩增目标序列；接着进行二次扩增，使用内部引物对初步扩增产物进行进一步扩增；最后进行检测，确定是否存在目标序列。

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCHO配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心52分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。

样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = RNA 浓度= ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × μg/μl = μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围到。

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。

样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = RNA 浓度= ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × μg/μl = μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围到。

rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。

本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。

同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。

引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。

反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。

一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。

这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。

反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。

反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。

RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。

引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。

二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。

PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。

PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。

PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。

每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。

变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。

三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。

凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。

RT-PCR步骤
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。

在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。

RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。

本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。

原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。

RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。

在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。

2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。

PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。

3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。

4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。

5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。

通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。

实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。

提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。

2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。

需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。

按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。

反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。

RT-PCR详细图文解析一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

RTPCR技术原理
RTPCR是一种常用的遗传学分析技术，通过在实验室中模拟自然界的PCR过 程，扩增DNA片段，从而实现对基因的分析和研究。
RTPCR技术原理
什么是RTPCR技术
RTPCR技术是一种基于PCR扩增原理开发而来的遗传学分析方法，可以高效地复制和研究 DNA序列。
RTPCR技术的优点
RTPCR技术具有高灵敏度、高特异性、高通量和快速等优点，成为现代分子生物学研究中 不可或缺的工具。
RTPCR技术利用PCR反应中的循环式 扩增机制，快速复制目标DNA序列， 从而使其在检测中能够得到可靠的结 果。
RTPCR技术原理
RTPCR技术的应用领 域
RTPCR技术在医学领域被 广泛应用于疾病诊断、遗 传性疾病筛查、药物研发 等方面。
RTPCR在食品安全领 域的应用
RTPCR技术可以用于检测 食品中的致病菌、转基因 成分、有害物质等，保障 食品安全。
RTPCR技术原理
1
RTPCR反应体系组成
2
RTPCR反应体系包括RNA、逆转录酶、
引物、酶、核酸酶和缓冲液等多种组
分，以保证反应的高效、特异性和稳
3
Байду номын сангаас
定性。
RTPCR流程介绍
RTPCR技术包括反转录和PCR两个基 本步骤，通过这两个步骤可以将RNA 转录为cDNA并扩增目标DNA序列。
RTPCR放大机制
2 RTPCR技术的发展趋势
RTPCR技术将更加智能化、快速化、低成本化，实现更高效的基因分析和诊断。
3 RTPCR技术的未来应用简述
RTPCR技术有望在个性化医疗、精准农业和环境污染治理等领域得到更广泛的应用。
RTPCR技术原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。

(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。

2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。

由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。

缺点
对操作人员要求较高
RTPCR技术的操作较为复杂，需要经过专 业培训的操作人员才能保证结果的准确性
。
成本较高
RTPCR技术需要昂贵的仪器和试剂 ，导致检测成本较高，可能限制其
在资源有限地区的普及。
A
B
C
D
可能出现交叉污染
在操作过程中，如果样品或试剂受到污染 ，可能会导致交叉污染，影响检测结果的 准确性。
《rtpcr技术原理》ppt课 件
目录 CONTENT
• RTPCR技术概述 • RTPCR技术原理 • RTPCR实验操作流程 • RTPCR技术的优缺点 • RTPCR技术的应用实例
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术定义
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 检测DNA片段的扩增情况，并实时监测其变化的技术。
2000年
ABI公司推出高分辨率熔解曲线分析 技术，提高了SNP分型和突变检测的 准确性。
2004年
基于焦磷酸测序原理的实时荧光定量 PCR技术问世，提高了检测通量和灵 敏度。
RTPCR技术的应用领域
基因表达分析
突变检测
通过比较不同组织或不同处理条件下基因 的表达水平，研究基因的表达调控机制。
用于检测DNA序列中的点突变、插入和缺 失等变异，用于遗传病、肿瘤等疾病的诊 断和监测。
基因突变检测
总结词
RTPCR技术能够高效地检测基因突变，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。
详细描述
基因突变是许多遗传性疾病的诱因，RTPCR技术通过对特定基因的扩增和荧光 检测，能够快速、准确地检测出基因突变位点及类型。这有助于遗传性疾病的 早期诊断和针对性治疗，为患者提供更好的医疗方案。

RT-PCR 操作步骤（20 ul反应体系）一、试剂准备1 RNA提取试剂：Trizol1.1 氯仿1.2 异丙醇1.3 无水乙醇1.4 0.1%DEPC水2 第一链cDNA合成试剂盒3 PCR：荧光定量试剂盒3.1 目的基因引物3.2 内参基因引物二、仪器、耗材离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液枪、离心管盒。

三、操作步骤1 总RNA的提取1.1 均质化组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆1.2 相分离转入一新EP管中（1.5ml），室温孵育5min；加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈15s），室温孵育2~3min；4℃ 10000 g离心15min（下层红色，中间相，上层无色水相）；注：RNA存在于水相中，水相体积约为均质液60%。

1.3 RNA沉淀转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温孵育10min；4℃ 12000 g 离心15min；1.4 RNA洗涤弃上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，4℃10000 g 离心5min（只做一次）；注：①无Ｒnase水配置：一般少配点儿，带胶塞的瓶子（250 ｍl），0.25ml DEPC ＋250ml双蒸水（先加DEPC），过夜，高压灭菌（30 min），高压是切记瓶口放一截细线，防止液体喷出。

冷却后4 ℃保存即可；②75%乙醇：即用即配，假如用4ml 75%乙醇，就吸取3ml无水乙醇，1ml无Ｒnase水；③样品可储存于75%乙醇中，-20℃保存至少一年。

1.5 RNA溶解倒掉上清，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥；加20ul DEPC水至EP管中，吹打几次；在55℃~60℃孵育10 min(或手握10min)，使RNA充分溶解。

1.6 RNA浓度测定调零：750 ul DEPC水；测量：745 ul DEPC水+5 ul RNA（稀释150倍，可根据实际情况调整）总RNA浓度=OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml=OD260×6 ug/ul注：OD260/OD280应在1.8~2.0之间。

RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。

下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。

逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。

•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。

引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。

•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。

2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。

•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。

2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。

•混合反应液，然后进行逆转录反应。

此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。

2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。

•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。

•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。

PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。

2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。

•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。

•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。

3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。

rt-qpcr是一种结合了逆转录和实时荧光定量PCR技术的方法，用于对RNA分子进行定量检测。

其原理主要包括三个方面：逆转录、PCR 扩增和实时荧光定量检测。

1. 逆转录rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA，这是通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）催化的反应来实现的。

逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。

2. PCR扩增在cDNA合成完成后，接下来是PCR扩增反应。

PCR扩增需要引物（primers）来选择性地扩增目标基因的片段。

在PCR过程中，引物与模板结合，逐渐扩增出大量目标片段，这些片段即为实验所关注的RNA分子的转录产物。

3. 实时荧光定量检测在PCR扩增过程中，可以加入SYBR Green等实时荧光染料，以实现实时监测PCR反应过程中产生的DNA片段数量。

这种实时荧光检测技术可以实现对PCR反应的动态观察，并能够定量分析反应体系中的DNA含量。

rt-qpcr实验步骤主要包括样品准备、逆转录、PCR扩增和荧光定量检测，以下为详细步骤：1. 样品准备首先需要准备待检测的RNA样品，其中包括目标RNA分子的提取、纯化和定量等工作。

样品的处理质量将直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。

2. 逆转录将RNA样品与逆转录酶、随机引物和dNTPs等混合物一起进行逆转录反应。

逆转录过程一般包括以下步骤：首先将RNA与随机引物混合，然后加入dNTPs和逆转录酶，进行逆转录反应。

3. PCR扩增在逆转录完成后，将逆转录得到的cDNA作为模板，与特定引物和PCR Master Mix（包括酶、缓冲液和dNTPs等）进行PCR扩增反应。

PCR扩增条件需要根据引物的特性和目标片段的长度进行优化，以保证扩增反应的特异性和准确性。

4. 荧光定量检测在PCR扩增过程中，引入实时荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针）来进行荧光定量检测。

逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。

一、总RNA的提取见总RNA的提取相关内容。

二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。

现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。

在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。

轻轻混匀，离心。

42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；5．于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。

-20℃保存备用。

三、PCR1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。

深入理解rt pcr原理及应用标题：深入理解RT-PCR原理及应用引言：RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一项重要的实验技术，广泛应用于分子生物学和医学研究领域。

本文将深入探讨RT-PCR的原理、操作步骤以及其在基因表达分析、传染病诊断和生物医学研究中的应用。

通过本文的阐述，读者将能够更好地理解RT-PCR的工作原理，并对其潜在应用有更全面的了解。

一、RT-PCR的基本原理1.1 反转录过程反转录过程是RT-PCR的核心步骤之一，其将RNA模板转录为相应的互补DNA（cDNA）。

该步骤涉及到逆转录酶的使用，它能够将RNA 模板上的核酸序列转录为互补的DNA序列。

1.2 PCR扩增过程PCR扩增是RT-PCR的另一个重要步骤，其能够使得少量的目标DNA 序列在体外迅速扩增至丰富、可检测的数量。

PCR扩增通过反复进行热循环，包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。

在合适的条件下，DNA模板将被不断复制，生成指数级增加的扩增产物。

二、RT-PCR的操作步骤2.1 样本和试剂的准备在开始RT-PCR实验之前，首先需要准备好待分析的样本和所需的试剂，包括RNA提取试剂、RT反应试剂盒和PCR扩增试剂盒等。

2.2 反转录反应反转录反应是RT-PCR的第一步，其将RNA转录为cDNA。

该步骤中需要逆转录酶和引物，逆转录酶能够合成互补的DNA链，引物用于定向引导逆转录酶合成。

2.3 PCR扩增反应在完成反转录反应后，接下来是PCR扩增反应。

PCR扩增反应需要合适的引物以及热稳定的DNA聚合酶。

通过合理设计引物和优化反应条件，可以实现特定基因序列的选择性扩增。

三、RT-PCR应用领域3.1 基因表达分析RT-PCR被广泛用于基因表达分析，可以检测和定量目标基因在不同组织和细胞类型中的表达水平。

这项技术能够揭示基因在生物体中的表达模式，并为研究基因功能、生物发育和疾病机制提供重要依据。