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液相色谱操作范文液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，主要用于化学分析、药物分析、食品分析和环境监测等领域。
液相色谱的基本原理是将待分离物质溶解在流动相中，通过与固定相的相互作用来实现分离。
一、液相色谱的基本原理液相色谱的分离原理是利用固定相与流动相中成分的相互作用来实现的。
固定相可以是多种材料，如吸附剂、离子交换剂和分子筛等。
流动相可以是有机溶剂、水或它们的混合物。
待分离物质在流动相中溶解后，通过与固定相的相互作用来实现分离，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而实现分离。
液相色谱通常包含以下几个基本部分：进样系统、柱子、检测器和数据分析系统。
进样系统负责将待分离物质注入到流动相中；柱子是液相色谱的核心部件，其中填充有固定相，用于分离待分离物质；检测器可以通过测量吸收度、荧光强度或电导率等来监测待分离物质的浓度；数据分析系统用于处理和分析检测到的信号，得到定量或定性结果。
二、液相色谱的操作步骤1.准备工作：首先检查液相色谱仪是否正常工作，确认流动相和固定相的可用性和质量。
根据实验要求准备样品，并将其溶解在适当的溶剂中。
2.预洗柱子：将柱子连接到液相色谱仪上，用一些纯溶剂通过柱子预洗，以去除柱子中的杂质和残留物。
3.进样：将待分离的样品通过自动或手动进样系统注入流动相中，控制样品的进样量和进样速度。
4.运行液相色谱：首先进行梯度洗脱或等温洗脱，根据实验要求调整流动相的组成和流速。
在色谱柱柱头位置，质谱柱附近安装检测器，以实时监测待分离物质的浓度。
5.数据分析：通过检测器获得的信号，使用数据分析系统处理和分析数据，得到待分离物质的浓度和组成。
6.清洗柱子：运行完液相色谱之后，将柱子从系统中取下，并用适当的溶剂清洗柱子，以去除附着在柱子上的待分离物质和杂质。
三、液相色谱的常见应用1.化学分析：液相色谱在药物、农药、生物学和材料科学等领域中被广泛应用，可以分析和鉴定待分离物质的成分和结构。
单选题1、下列不属于水溶性的维生素的是1/46A.维生素EB.维生素B12C.泛酸D.维生素C正确答案：A试题解析：水溶性维生素包括维生素B族和C族，维生素E属于脂溶性2、维生素是一类？2/46A.高分子有机化合物B.低分子有机化合物C.无机化合物D.微生物化合物正确答案：B试题解析：维生素是一类维持人体正常生理代谢功能所必需的低分子有机化合物3、下列维生素中参与转氨基作用的是3/46A.磷酸吡哆醛B.泛酸C.TPPD.烟酰胺正确答案：A试题解析：磷酸吡哆醛和磷酸吡哆酸是维生素Ｂ６在生物体内存在的主要形式，它们是氨基转移酶的辅酶，它们之间相互转变起着传递氨基的作用4、维生素E的多种异构体中哪个活性最高4/46A.α－生育酚B.β－生育酚C.γ－生育酚D.δ－生育酚正确答案：A试题解析：维生素Ｅ又名生育酚，包括８种化合物，即α－生育酚、β－生育酚、γ－生育酚、δ－生育酚和α－生育酚、β－生育酚、γ－生育酚、δ－三烯生育酚，α生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富、活性最高的维生素Ｅ形式。
5、下列不是维生素E鉴别方法的是5/46A.硝酸反应B.三氯化铁反应C.三氯化锑反应D.紫外光谱法正确答案：C试题解析：三氯化锑反应用于鉴别维生素A6、在维生素E的三氯化铁鉴别反应中，与联吡啶生成红色配离子的是6/46A.NO3-B.Cl-C.Fe3+D.Fe2+正确答案：D试题解析：维生素Ｅ在碱性条件下，水解生成游离的生育酚，生育酚经乙醚提取后，可被FeCl3氧化成生育醌；同时被还原为Fe2+ ,Fe2+与联吡啶生成红色的配位离子。
7、维生素E的0.01%无水乙醇液，有最大吸收的波长处在7/46A.284nmB.254nmC.332nmD.620nm正确答案：A8、关于维生素C，不正确的是8/46A.不溶于水B.不溶于乙醚C.含有不饱和键D.无臭味酸正确答案：A试题解析：维生素C属于水溶性9、下列药物的碱性溶液，加入铁氰化钾后，再加正丁醇，显蓝色荧光的是9/46A.维生素AB.维生素CC.维生素B1D.维生素E正确答案：C试题解析：维生素B1鉴别-硫色素荧光反应10、能发生硫色素特征反应的药物是10/46A.维生素AB.维生素CC.维生素B1D.维生素E正确答案：C试题解析：硫色素反应是维生素B1的专属性鉴别反应11、2，6-二氯靛酚反应利用什么性质进行鉴定维生素C11/46A.糖的性质B.酸性C.还原性D.荧光反应正确答案：C试题解析：2，6-二氯靛酚为氧化剂，维生素C具有还原性12、测定维生素C注射液的含量时，在操作过程中要加入丙酮，这是为了12/46A.保持维生素C的稳定B.增加维生素C的溶解度C.加快反应速度D.消除抗氧剂的干扰正确答案：D试题解析：注射剂中常含有作为抗氧剂的亚硫酸氢钠，在滴定前应加入丙酮（或甲醛）使之与亚硫酸氢钠反应生成加成物而掩蔽起来，以消除干扰13、维生素C碘量法测定要排除亚硫酸的影响则在滴定前加入13/46A.丙酮B.酒石酸C.草酸D.丙醇正确答案：A试题解析：注射剂中常含有作为抗氧剂的亚硫酸氢钠，在滴定前应加入丙酮（或甲醛）使之与亚硫酸氢钠反应生成加成物而掩蔽起来，以消除干扰14、维生素C可在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水等反应，转变成糠醛，再与吡咯在50℃反应生成什么颜色14/46A.蓝色B.无色C.红色D.黄色正确答案：A试题解析：维生素C利用糖的性质鉴别15、维生素C的含量测定主要基于其什么性质15/46A.糖的性质B.酸性C.还原性D.荧光反应正确答案：C试题解析：维生素C的含量测定基于其具有强的还原性，可被不同氧化剂定量氧化而进行。
7．1 色谱原理与分类一、色谱（Chromatography）的概念色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。
优点：分辨率高，设备简单、操作方便，是生化产品纯化、分析的重要手段，这一切均源于其特殊的分离模式，即塔板理论。
二、原理以典型的柱色谱分离设备为例（图7.1）。
互不混溶的两相分别称为固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。
固定相填充于柱中，在柱的顶端(入口)加入一定量的料液后，连续输入梳动相，料液中的溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质，产生分配平衡。
分配系数大的溶质在固定相上存在的几率大，随流动相移动的速度小。
这样，溶质之间由于移动速度的不同而得到分离。
三、色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种。
1．流动相的相状态：气相色谱法、液相色谱法、超临界色谱法液相色谱法可分为多种，如凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱、疏水性相互作用色谱和亲和色谱等。
2. 固定相的相状态：固体（吸附色谱法）、液体（分配色谱法）和固定于固体表面的液体薄层（以固体为载体）的分配色谱法3．固定相的形状纸色谱法多用于分析目的薄层色谱法多用于分析目的柱色谱法大量制备分离4．压力低压（小于0.5MPa）、中压（0.5~4.0 MPa）、高压（4.0~40MPa）5．径向流色谱径向流色谱大规模分离造价高实际应用较少轴向流色谱应用较多6．分离操作方式展开色谱、迎头分析、顶替展开7．分配原理色谱分离方法很多，种类有四、五十种。
但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱四、常用术语吸附剂：色谱中能可逆结合并又能使所结合的被分离物解离的支持物或固定相。
固定相：由色谱基质组成的。
可以是固体物质如吸附剂、离子交换剂等；也可以是液体物质如固定在纤维素或硅胶上的溶液。
流动相：在色谱过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。
柱色谱时，称洗脱液 或洗涤剂；薄层色谱时称展层剂。
装柱：将经预处理并经过洗脱剂平衡过的吸附剂加入色谱柱的 过程。
上样：或加样。
指将待分离的样品加到色谱柱的操作。
洗脱：把加到柱上的待分离样品，在吸附剂吸附后，用洗脱液或洗涤剂冲洗柱子，实现被吸附样品分离的过程。
操作容量：指在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数表示。
数值大，表明基质对某种成分的结合力强；反之，则小。
床体积（Vt ）： 指膨胀后的基质在色谱柱中所占有的体积。
基质体积(Vg)：指基质自身所具有的体积。
内水体积(Vi)：指基质颗粒内部体积的总和。
外水体积 (Vo)：指基质颗粒之间（空隙）体积的总和。
关系：Vt= Vo + Vi + Vg膨胀度（V ） ：在一定溶液中，单位重量的基质充分膨胀后所占有的体积。
即每克膨胀基质所具有的床体积。
一般，亲水基质比疏水性的大。
7．2 色谱过程理论基础平衡模型非常粗略，理论板模型比较切合实际。
1. 分配系数：可由Langmuir 方程得出K d---分配系数q 、c---溶质在固相和液相中的浓度2. 溶质的保留时间（t R ）和保留体积（V R ）：色谱柱内不同浓度的溶质从柱内流出所需的时间为溶质的洗脱时间或保留时间t R 。
洗脱该浓度的溶质所需流动相体积为溶质的保留体积V R 。
反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。
cqK d3. 阻滞因子R f阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比迁移距离流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离=f Rs d m m f A K A A R += 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小4. 洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积。
s d m e V K V V +=不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异5. 色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N---理论塔板数 θR ---保留时间W 1/2---半峰宽 W b ---峰底宽度理论塔板高度：L---柱长6.分离度(自习)分离度又称分辨率 分离度是两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值之比。
221545)(./W N R θ=216)(W N R θ=NL H =21122W W R R R s +-=)(θθ 分离度随理论板数的增加而增大，当两种溶质的分配系数（或容量因子）相差较小（即选择性较小）时，需要较多的理论板数才能获得较大的分离度。
7．3 吸附色谱(Absorption chromatography)一、 吸附色谱基本原理固定相: 颗粒状的基质。
表面上有许许多多的吸附位点。
可通过静电引力、范德华力与蛋白质、核酸等结合。
并且由于各种欲分离物质结构不同，吸附力强弱不同。
流动相：一般为液体。
可解吸附。
不同吸附力的物质解吸附快慢不同。
过程：吸附、解吸附、再吸附的连续过程。
简言之：欲分离的物质，依据它们结构的差异性或分配系数的不同而被分离。
二、吸附剂1.吸附剂的选择相似相溶原则：极性物质选择极性吸附剂（但要防止极性过强 ，不利于解吸附）；非极性物质选择非极性吸附剂。
对吸附剂而言，要求其选择性强；较稳定；颗粒小（表面积大）；均匀、成球型；价廉。
2.常见的吸附剂（1）极性吸附剂：CaCO 3、羟基磷灰石、聚酰胺、硅胶、 Al 2O 3、人造沸石（离子交换剂）硅胶:活性硅胶结构特点：颗粒状、多孔、表面有许多硅醇基团—Si —OH ，功能基团用途：分离氨基酸衍生物、甾体激素、皂苷类、类脂、色素等适用范围： 含水量低时（﹤ 17%）才作为吸附色谱的吸附剂。
否则，是分配色谱的固定相。
（2）非极性吸附剂：活性炭（3）大孔聚合物吸附剂简称大孔或大网格吸附剂。
结构特点：树脂类物质，但无交换基团；仅有多孔骨架。
性质：类似于硅胶或活性炭，即具有兼性。
特点：选择性好、解吸附容易、机械强度好、可反复使用、流体阻力小。
通过改变孔架结构或极性，可适用于吸附多种有机物质。
分类：非极性、中等极性、极性三类。
如：美国的：Amberlite-XAD 、ES 、DS日本的：Diaion HP 等原理：依分子间引力吸附有机物质。
原则：相似相容（亲）吸附力大小取决于树脂的化学结构和物理性能；溶质及溶液的pH 、离子强度、溶剂的介电常数等性能。
解吸附：由于该类树脂对有机物的吸附力小于活性炭，因此解吸附较容易。
具体操作时可采用：水溶性有机物质——用水溶性有机溶剂，如低分子量的醇、酮及其水溶液解吸附。
弱酸性物质——用碱解吸；弱碱性物质——用酸解吸；含高浓度盐物质——用水解吸；挥发性物质——用热水或蒸气解吸。
应用：生化产品如蛋白质、酶等制剂分离。
三、洗脱剂1. 要求：纯度较高；稳定性好（不与固相物和分离物起反应）；洗脱较完全；黏度小；易和所需成分分开。
一般用有机溶剂洗脱，有时也需要梯度变化（包括盐浓度、极性）。
2. 选择原则：完全洗脱分离成分；用量少；洗脱时间短。
四、色谱柱的制备与操作五步：制备→上样→洗脱→绘制曲线→再生(一)制备国内主要是玻璃色谱柱，国外有塑料的，可伸缩。
柱大小、粗细多样。
柱下有筛板，石英砂烧制，有3#、5#型号，区别在于筛孔大小不同。
筛板空间越小越好。
1.柱大小选择依床体积确定。
Vt =πr2hVt 由吸附剂用量和膨胀度决定。
d：h=1：10～1：40 （d 直径，h柱高）2. 吸附剂用量具体根据操作容量和分离物的性质（亲和力、与杂质理化性质的差异等）决定。
一般，分离物：吸附剂量=1：30～50 （特殊的100）吸附剂用量、膨胀度、分离物量及性质决定使用的柱子大小。
（二）装柱分湿装和干装。
湿装：基质泡在流动相或一定溶液中膨胀后加入。
干装：直接装，均匀。
如硅胶，流动相为有机溶剂。
缺点：不易排净气泡。
湿装操作如下（此法对各种基质都适用）：1.将洗净的柱子垂直固定。
2.加适量的溶剂，排走柱中气泡。
3.将浸泡好的吸附剂一边搅拌，一边加入柱中（一定注意连续性，谨防中断，出现断裂面）。
4. 待自然沉降至柱高的1/4-1/3时，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使上端悬浮液徐徐下降，直到所需高度。
5. 平衡。
以2-3倍柱体积的平衡液，直至基质的pH与流动相的pH 一致。
要求：吸附基表面要平整、无气泡、无裂缝。
为此，须自始至终浸没在溶剂中。
流动过程中，柱中液体也要高于胶面5cm，以防流动相液滴冲击而损坏胶面。
一般可在胶面上放一块大小合适的圆形滤纸片。
（三）上样1．样品浓度的选择加样体积﹤1/2 Vt 。
体积大小对分离效果至关重要，体积小，分离效果好，反之，差。
2．操作要点：让基质表面缓冲液进入固定相，且使液面平衡样品需均匀进入。
沿管壁加样，可减少冲力，但容易产生渗漏。
待样品液流到基质表面时，用滴管加入洗脱剂直高出液面5cm。
（四）洗脱1．在柱上端接洗脱剂进行洗脱。
控制适当的、均匀的流速（不同基质，流速不同，应摸索）。
2．同时与部分收集器接通，立即进行分级收集。
按体积或时间分管收集。
收集体积为总洗脱体积（Ve）的2～5%作为收集一次(管)的体积。
体积小分级效果好，但体积太小，损失大。
按测定方法灵敏度来定，不同方法要求的体积不同。
3．对每管的浓度或活性进行测定。
（五）吸附剂再生大多数的吸附剂都可重复利用。
再生：是指用适当的方法处理来恢复原来的性能。
不同基质，方法不同。
五、应用1．用于分离极性不同的化合物2．浓缩作用静态吸附—直接加入到溶液中。
动态吸附—有流动相存在下的吸附。
动态效果好于静态。
静态适合于大工业生产。
二者可结合使用。
7．4 凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography ,GFC）凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography , GFC）利用凝胶粒子（通常称为凝胶过滤介质）为固定相，是根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。
凝胶过滤色谱又称尺寸排阻色谱。
一、凝胶结构与性质1.结构：立体网状2.性质：a)排阻极限(exclusion limit)：凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
b)分级范围(fractionation range)：即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。
Sephadex G—50的分级范围为1.5~30kD。
c)凝胶粒径：凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。
