体外构建组织工程骨-软骨复合组织

软骨组织工程实验中体外培养条件优化软骨是人体中重要的结缔组织之一，负责保护关节，减轻关节之间的摩擦和冲击。

然而，软骨损伤的修复能力较差，导致许多关节疾病的发生。

为了解决这个问题，研究人员开始使用软骨组织工程的方法来修复软骨损伤。

在软骨组织工程中，体外培养是一个关键步骤，它可以为移植到患者体内的软骨细胞提供一个适宜的环境，促进其生长和分化。

因此，优化软骨组织工程实验中的体外培养条件变得至关重要。

在软骨组织工程实验中，体外培养条件的优化可以包括培养基成分的选择、细胞密度、培养时间、生长因子的添加和物理环境的调节等多个方面。

首先，选择合适的培养基成分是优化体外培养条件的关键。

培养基中的成分应能够提供细胞所需的营养物质和生长因子，并且能够维持细胞的正常代谢和生长。

常用的培养基成分包括碳水化合物、氨基酸、维生素、矿物质和生长因子等。

根据不同的需求，可以选择使用不同的培养基，如DMEM、RPMI 1640和F-12等。

此外，还可以添加一定比例的血清来提供细胞所需的生长因子和胶原蛋白等。

其次，细胞密度是影响体外培养条件的另一个重要因素。

细胞密度过低会导致细胞生长缓慢，甚至停止生长，而细胞密度过高则会引起细胞死亡和自相互作用的影响。

因此，在培养软骨细胞时，应该根据细胞的种类和培养器皿的大小选择合适的细胞密度。

一般来说，每平方厘米的细胞密度为1×10^5 - 5×10^5个细胞。

此外，培养时间也是优化体外培养条件的一个重要考虑因素。

软骨组织的发育需要足够的时间来进行，因此，培养时间应该使得细胞能够达到足够的数量和分化度。

可根据实验的需要和细胞类型来确定合适的培养时间。

一般情况下，培养时间在2-4周左右。

另外，添加适量的生长因子可以促进软骨细胞的增殖和分化。

生长因子可以通过调节细胞的信号传导途径来影响细胞的生长和分化。

目前常用的生长因子包括转化生长因子β（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）、成骨细胞生成素（OPG）等。

应用旋转式生物反应器体外构建组织工程软骨的实验研究的开题报告一、研究背景随着人民生活水平的提高，医疗技术不断进步，组织工程学作为一种新兴的修复和再生医学技术，被广泛研究和应用。

组织工程软骨是其中一个重要研究领域。

软骨是人体内一种具有细胞、基质和结构的特殊组织，它对人体保持形态、支持和保护结构、缓冲、润滑和吸收冲击有着十分重要的作用。

然而，软骨损伤自身的修复能力很差，传统的治疗手段效果有限，有时甚至加重病情。

因此，组织工程软骨技术的研究和应用在临床治疗方面具有重大的意义。

目前，组织工程软骨的制备方法主要有三类：自体软骨移植、异体软骨移植和实验室体外培养。

虽然前两种方法有着较高的成功率，但也存在种种限制和风险，例如损伤原部位和免疫排斥反应等。

因此，实验室体外培养方法逐渐成为研究的热点领域。

值得注意的是，旋转式生物反应器在软骨组织工程中已经得到了广泛的应用。

其通过调节组织工程构建中的生物环境条件，提高细胞生长和生成细胞外基质的速率，从而得到具有良好结构和机械特性的软骨组织。

二、研究目的本项目旨在探讨旋转式生物反应器体外构建组织工程软骨的可行性和效果，并分析其该技术的优势和局限性。

通过体外培养新鲜和定向分化的成软骨细胞，以多重生物学和生物化学标记为形态和化学上的指标，进行质量和组织形态学的比较研究，判断旋转式生物反应器对于组织工程软骨构建的促进作用，为软骨组织工程的研究和临床应用提供支持。

三、研究方法实验将主要采用体外培养的方法，应用旋转式生物反应器构建组织工程软骨。

实验方案包括以下几个步骤：1. 体外分离和定向分化成软骨细胞，获取需要的实验材料。

2. 将成软骨细胞悬浮于生理状况良好的培养基中，并在旋转式生物反应器中进行培养以促进细胞增殖和生成基质。

3. 在培养过程中，对细胞增殖情况和基质生成情况进行定期观察和记录，并进行相应的处理。

4. 通过组织学和生化分析等多种手段对旋转式生物反应器构建的组织工程软骨进行分析和评价。

体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤的修复【摘要】目的探讨体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤治疗的可行性。

方法①体外分离、培养、扩增骨髓基质干细胞，诱导分化培养为软骨样细胞；②以胶原膜为支架在体外构建组织工程软骨；③建立兔髋关节软骨缺损动物模型16只，对照组8只，实验组8只；应用组织工程软骨修复兔股骨头关节软骨缺损，8、16周后观察修复效果。

结果8周后大体标本显示关节软骨缺损为白色软骨样组织填充，组织切片显示缺损处有新生软骨形成，阿新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化检测有GAG和Ⅱ型胶原强阳性表达；16周后关节软骨缺损仍为软骨样组织修复，部分见表面粗糙，镜下见软骨细胞排列紊乱。

结论体外构建的组织工程软骨可用于修复兔股骨头关节软骨缺损，较长期的观察结果显示有退变倾向。

【关键词】骨髓基质干细胞；髋关节；软骨缺损；组织工程关节软骨损伤修复是骨科学研究的热点，组织工程技术的出现为关节软骨损伤的治疗提供新思路。

目前常用的研究方法为在体外培养扩增种子细胞，在体外与生物材料结合后直接植入体内修复关节软骨缺损[1]。

我们通过组织工程技术在体外构建组织工程软骨，并应用于修复兔股骨头关节软骨损伤，现报告如下。

1 材料与方法1．1 实验动物3月龄健康新西兰大白兔16只，雌雄对半，体质量2．1～3．4 kg，购自上海中科院实验动物中心。

1．2 主要实验仪器和试剂CO2培养箱（HERA），超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜（Olympus），DMEM培养液、0．25%胰蛋白酶、细胞因子TGF-β、b-FGF（Sigma），小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（北京中杉生物公司），RNA提取试剂盒（QIA），RT-PCR试剂盒（晶美生物公司），组织细胞染色（本院病理科提供），生物材料胶原膜由中科院生物医学工程研究院提供。

1．3 实验方法1．3．1 骨髓基质干细胞的获取可取自两侧髂棘，用16号骨髓穿刺针抽取骨髓2 ml，针筒内预先置入1 ml DMEM培养液（含肝素1 000 U），以3∶7的比例加入淋巴细胞分离液，以2 000 r/min，15 min离心，吸取中间单个核细胞层，再用DMEM培养液冲洗3次，血球计数板计数。

丝素蛋白无纺网支架体外构建组织工程化软骨朱俊;陈向军;郜元坤;田磊;李国义【摘要】目的:探讨丝素蛋白无纺网作为耳廓软骨细胞外支架构建组织工程化软骨的可行性.方法:取成年新西兰兔耳廓软骨,酶消化法获取软骨细胞,体外培养扩增后取原代细胞接种到制备好的丝素蛋白无纺网支架上,体外复合培养.每天倒置显微镜下观察细胞黏附、生长、增殖情况,于复合培养第3、7、10天时取材进行扫描电镜观察;于复合培养第1、2、4、6周取材进行组织学评价,同时取材通过RT-PCR方法检测复合物上软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达情况.结果:48 h后软骨细胞已黏附于丝素蛋白纤维上,72 h后细胞开始分泌少量细胞外基质;电镜下观察显示软骨细胞及分泌的薄层细胞外基质主要分布于支架材料表面.组织学观察显示2周时支架浅层已有一定厚度软骨组织,可见少量类软骨陷窝,4周和6周时支架浅层软骨组织增厚,软骨陷窝增多,但支架内部软骨细胞数目少,细胞呈星形或梭形,细胞分泌的基质也很少.RT-PCR检测显示在各检测时间点均有Ⅱ型胶原mRNA的表达.结论:兔耳廓软骨细胞在丝素蛋白无纺网支架上已初步形成软骨样组织,但培养条件应进一步优化.%Objective: To evaluate the feasibility of non-woven silk fibroin net as a biocompatible scaffold of the auricular chondrocytes for construction of tissue-engineered cartilage. Methods: Chondrocytes were harvested from auricular cartilage by trypsin and type II collagenase digestion, and expanded in culture flasks. The chondrocytes ( P1 ) were seeded into non-woven silk fibroin nets, and incubated in CO2 incubator. The adhesion, proliferation and growth of cells were observed under inverted microscope every day and the microstructure of the constructs was observed by using scanning electron microscope ( SEM) at 3 ,7 and 10 d after coculture. Theconstructs were harvested and analyzed by histology at 1,2 ,4 and 6 weeks after coculture, and the mRNA expression of type II collagen was examined using RT-PCR. Results:The scaffold was covered with chondrocytes at 48 h and these cells began to secrete extracellular matrix(ECM) at 72 h after coculture. The surface of scaffold was covered with chondrocytes and ECM under SEM. Stent shallow already had some cartilage tissue and a little lacunae at 2 weeks. The cartilage tissue thickened and lacunae increased, but the certer of stent had a little cells,which were star or spindle type and secreted a little ECM at 4 and 6 weeks. The mRNA expression of type II collagen was detected by RT-PCR at all time-points. Conclusions: Cartilage-like tissues can form at non-woven silk fibroin net with the auricular chondrocytes, but culture conditions should be further optimized.【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2012(037)011【总页数】4页(P1283-1286)【关键词】丝素蛋白;组织工程;软骨;耳廓;生物相容性材料【作者】朱俊;陈向军;郜元坤;田磊;李国义【作者单位】湖北医药学院附属太和医院,耳鼻喉科,湖北,十堰442000;湖北医药学院附属太和医院,耳鼻喉科,湖北,十堰442000;湖北医药学院附属太和医院,耳鼻喉科,湖北,十堰442000;湖北医药学院附属太和医院,耳鼻喉科,湖北,十堰442000;湖北医药学院附属太和医院,耳鼻喉科,湖北,十堰442000【正文语种】中文【中图分类】R318目前，国内外主要应用自体肋软骨雕刻和生物相容性材料代替耳廓软骨等方法修复先天性无耳、小耳畸形或外伤致较大耳廓缺损，但由于存在术后气胸、胸部畸形、异物反应、易外露、老化和感染等问题而影响疗效。

应用生物反应器及体外微团培养构建骨软骨复合体修复关节软骨损伤的实验研究的开题报告一、研究背景及意义骨关节软骨损伤是一种常见的疾病，随着人们年龄的增长以及运动损伤等原因，患者数量不断增加。

骨关节软骨损伤的治疗方法主要是手术治疗和药物治疗，但是手术治疗可能存在术后复发等问题，药物治疗效果较慢，且长期应用可能会产生副作用。

因此，寻找一种更加有效的治疗方法就变得尤为重要。

生物反应器及体外微团培养是一种新型的组织工程技术，通过人工构建生物反应器和体外微团培养技术，可以有效地培养出人体软骨细胞，并且形成类似于体内软骨组织的复合体。

该技术具有细胞数量多、生物学活性强、组织工程修复效果好等优点。

因此，将生物反应器及体外微团培养技术应用于骨软骨复合体的修复工作中，可能产生很好的治疗效果。

二、研究目的本研究旨在探讨应用生物反应器及体外微团培养技术构建骨软骨复合体修复关节软骨损伤的可行性和治疗效果，并且从细胞学和分子水平上对复合体的生物学特性进行研究，为临床治疗提供新的思路和方法。

三、研究内容1、设计软骨组织细胞的分离、扩增、定植技术。

2、研究构建骨软骨复合体的生物反应器及体外微团培养技术。

3、观察骨软骨复合体体外培养的生物学特性，包括细胞增殖、细胞形态、细胞分化等内容。

4、将骨软骨复合体移植到动物体内进行实验观察，评估其修复效果。

5、进行细胞学和分子水平研究，探讨骨软骨复合体的生物学机制。

四、研究方法1、软骨组织细胞的分离、扩增、定植技术。

2、采用生物反应器及体外微团培养技术，构建骨软骨复合体。

3、通过CCK-8法、细胞形态观察、RT-PCR、Western blot等方法评估骨软骨复合体的生物学特性。

4、动物实验评估骨软骨复合体的修复效果。

五、研究预期成果本研究预计可以得出以下成果：1、成功建立骨软骨复合体修复关节软骨损伤的模型。

2、构建骨软骨复合体的生物反应器及体外微团培养技术得到进一步完善和优化。

3、骨软骨复合体的生物学特性得到深入研究，为该技术在临床治疗中的应用提供新的证据。

组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的获取与培养[摘要]目的：探索体外培养组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的条件，并观察其部分生物学活性。

方法：采用机械-酶消化法对3周龄新西兰大白兔耳软骨和关节软骨消化来获得软骨细胞，采用全骨髓贴壁法来获得骨髓间充质干细胞，对两种细胞进行原代和传代培养，通过倒置相差显微镜观察细胞形态、绘制生长曲线、免疫组化染色等对细胞进行生物学特性分析。

结果：原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主，传代3次以后出现去分化。

形态学和免疫组化显示细胞3代以内可以保持表型稳定，具有较强的增殖及分泌细胞外基质的能力，而且耳软骨及关节软骨细胞在实验中没有表现出明显的生物学差别。

采用贴壁筛选法获得的bmscs呈长梭形或多边形，生长曲线呈“s”形，ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，细胞生长增殖能力旺盛。

结论：体外分离培养的软骨细胞和骨髓间充质干细胞符合组织工程要求，能够作为骨-软骨复合组织的种子细胞。

[关键词]组织工程；骨髓间充质干细胞；软骨细胞；种子细胞[中图分类号]q813.1 [文献标识码]a [文章编号]1008-6455（2012）05-0748-04obtainment and culture of seeding cells of tissue engineered osteochondral compositesliu peng1, fu chong-jian1, deng tian-zheng2, jiang ming1, li ji-guo1, yu shu-juan1, zhu guo-xiong1(1.department of stomatology, jinan general military hospital, jinan 250031,shangdong,china;2.department of stomatology, general hospital of the air force of pla) abstract: objective to explore the optimized conditions for isolation and culture of seeding cells of osteochondral composites and observe some biological features of the seeding cells. methods 3-week-old new zealand white rabbits were selected for bmscs and chondrocytes isolation and culture. articular cartilage cells were obtained by mechanical-collagenase digestion. bmscs were saparated using whole marrow culture method and purified by attachment method. morphology and growth characteristics were observed. results the cultivation of cartilage cells presented with polygonal or triangle, morphology and immunohistochemistry showed that stable phenotype could be maintained within three generations, and the biological characters of chondrocytes from ears or joints were almost the same. bmscs developed a spindle or polygonal appearance, growth curve was s-shaped, expression of type ⅱcollagen was positive. adhesive culture method was proved to be an effective method to provide a large number of bmscs. conclusion the chondrocytes and bmscs are suitablefor tissue engineering, and these can be used as seeding cells of osteochondral composites.key words: tissue engineering; bone marrow stem cells; chondrocytes; seeding cells骨-软骨复合组织主要存在于关节、肋骨等区域，尤其是颞下颌关节、膝关节等运动关节，并承担着重要的功能。

体外构建组织工程学骨软骨复合组织修复兔关节软
骨缺损的研究的开题报告
一、研究背景
关节软骨缺损是常见的骨科问题之一，在临床治疗中常遇到。

传统
治疗方法包括药物治疗、物理治疗和手术治疗等，但疗效有限。

体外构
建组织工程学骨软骨复合组织是近年来兴起的一种治疗方法，其理念是
通过细胞、生物材料和生物活性因子等组合，重建缺损组织结构和功能。

本研究旨在探究体外构建组织工程学骨软骨复合组织对兔关节软骨缺损
修复的疗效和安全性。

二、研究内容
1. 研究方案设计：选用健康成年雄性新西兰白兔，将左后肢骨关节
软骨切除制备关节软骨缺损模型。

2. 组织工程学体外构建：从兔耳组织中获得成骨细胞和软骨细胞，
通过培养和扩增后，制备骨软骨复合组织。

3. 手术治疗：将体外构建的骨软骨复合组织植入到相应兔的关节缺
损部位，术后定期复查、评价修复效果。

4. 评价指标：包括术后疼痛、步态表现、关节可活动度、关节软骨
形态和组织学检查等。

三、研究意义
通过本研究，可以探究体外构建组织工程学骨软骨复合组织修复兔
关节软骨缺损的疗效和安全性，为临床治疗提供参考。

同时，还可以为
开展相关研究提供一定的借鉴和启示。

软骨成熟组织工程
软骨成熟的组织工程是一种利用生物材料和细胞工程技术，通过体外培养和生物学方法培养出成熟的软骨组织。

这种方法通常涉及三个主要方面：细胞来源、支架材料、以及培养和植入的过程。

以下是软骨成熟的组织工程的一般步骤：
1. 细胞来源：
* 从患者自身或其他来源（例如捐赠者或细胞库）获得软骨细胞。

这些细胞可以来自关节或软骨组织。

2. 支架材料的选择：
* 选择一种适当的支架材料，用于提供支撑和促进细胞附着、增殖和分化。

支架材料通常是生物可降解的，可以为软骨细胞提供三维生长的环境。

3. 细胞种植和培养：
* 将获得的软骨细胞与支架材料结合，形成细胞/支架复合体。

这个复合体随后被培养在体外的生长培养基中，提供适当的生长因子、营养和生物环境，以促进软骨细胞的增殖和分化。

4. 体外培养期：
* 细胞/支架复合体在体外进行培养，通常需要一段时间，以确保软骨组织得以适当的生长和成熟。

培养过程中需要监测细胞的生长状态和支架的降解情况。

5. 植入体内：
* 成熟的软骨组织可以通过外科手术植入到患者体内，用于修复软骨缺损或受损区域。

植入后，软骨细胞继续生长、分化和逐渐融入患者的组织。

6. 后续监测和治疗：
* 对患者进行后续的监测，以确保植入的软骨组织在体内稳定成熟，且没有出现排斥反应或其他不良反应。

必要时，可能需要进行后续的治疗或调整。

这种软骨组织工程方法旨在提供一种可持续的、生物相容的治疗方式，用于修复软骨损伤或疾病。

然而，该技术仍在不断发展和完善中，以提高软骨成熟的效果和长期效果。