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临床荧光定量PCR检测中问题及原因分析作者：杨红樱来源：《中国实用医药》2011年第02期随着定量PCR商品试剂盒的推出，目前国内很多医疗机构开展了病原体核酸检测，但PCR反应最大的特点是具有较大扩增能力和极高的灵敏度，稍有不慎即可引起检测结果较大的差异和极微量的污染，即可造成假阳性。
1 检测结果差异大PCR检验操作主要是标本处理中的核酸提取步骤，其中涉及的主要是移液器的使用，尽管操作简单，但均为微量操作。
目前国内所使用的Taqman荧光定量PCR测定技术均为外标定量方法，PCR反应体系小的区别也会对扩增效率造成较大的影响，从而使模板定量测定精密度和重复性不佳，从实际工作来看，不同操作者所测的结果差异较大，强调样本核酸提取的标准化，核酸提取不规范、不准确，后面的扩增和定量测定等于零。
可通过操作者有计划的培训，强化实验技能，不同操作者平行性检测比对，室内质量控制，室间质量评价来达到自我教育作用，从而提高整体试验质量。
2 污染PCR检测的污染主要来自3个方面，第一方面是样本间交叉污染，包括收集容器被污染或标本放置时由于密封不严作者单位：671000云南省大理州人民医院检验科溢于容器外，或容器外有标本而造成相互间的交叉污染；样本核酸模板在提取过程中高温加热时崩盖形成气溶胶污染；移液器污染导致标本间的污染。
第二方面是PCR试剂的污染，包括PCR试剂配制过程中由于移液器、容器、双蒸水及其他共用溶液被PCR核酸模板污染。
第三方面是PCR扩增产物的污染，包括在对扩增产物操作时比较剧烈摇动扩增管，开盖吸样时及用污染移液器的反复吸样都可引起污染。
实时荧光定量PCR检测实现了扩增管的闭管检测，最大程度上避免了扩增产物的污染。
临床PCR室污染监测可通过设置对照试验来达到目的，包括：①阳性对照：它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要参考标志；②阴性对照：强调PCR实验每次必须做阴性对照且包括：a、标本对照：用鉴定后的正常血清作对照，监测实验室以前扩增产物污染，由实验操作所致的标本间的交叉污染和扩增反应试剂的污染；b、水对照：以水为模拟标本经历整个核酸提取过程，功能同标本对照，但对污染的反映更灵敏；c、试剂对照：仅含PCR试剂不加任何DNA或RNA模板直接进行PCR扩增，以监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性；③重复性试验。
荧光定量pcr实验常见问题梳理一、无Ct值或Ct值延迟出现:扩增曲线信号不佳，曲线不平滑:标准曲线线性差。
1.扩增产物大小不合适：实时荧光定量PCR扩增片段的长度通常在80-150 bp之间，如果调整反应的时间有可能扩增500bp的片段。
2.PCR反应过程中退火及延伸的时间过短或过长：应根据扩增片段的大小予与调整。
3.MgCl,浓度不合适：按0. 5mm的间距调整MgCI2的浓度。
4.循环数设置不足：最少设置35个循环，可以增加到45个循环。
超过45个循环以上背景信号会增加，对实验结果的分析造成干扰。
5.在错误的PCR反应步骤采集信号：应检查程序设置确保信号的采集是在退火的步骤进行的。
6.加样的误差及错误：注意每次加样的一致性及移液器的校正。
7.DNA模板的起始浓度过低，不能被检测出来：如果模板的浓度未知，最初的实验可以采用较高浓度的模板并进行梯度稀释。
最高的模板浓度不超过500ng基因组DNA。
8.模板DNA的降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。
9.梯度稀释标准样品的方法不规范:应注意梯度稀释样品的操作规范，准确。
10.引物或探针设计有误，存在二级结构：通过琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量PCR反应结果，是否有PCR产物存在。
如果没有PCR扩增产品，应使用引物设计软件检查引物的各种指标是否合适: Tm. 与模板的批配度、二级结构、扩增片段的长度、非特异型扩增的情况。
具体的数据请翻阅前面的相关原理说明11.引物之间的Tm值相差过多：上下游引物的Tm值差不应超过4C。
12.引物或探针的使用浓度不合适：应将浓度控制在50- 900 nM之间，探针的浓度低于引物的浓度。
13.引物或探针降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。
14.探针设计的位置在扩增片段的5’端：应将探针设计的位置靠近扩增片段的3”端15.探针被氧化：避免用酸性溶液溶解探针，否则会产生高背景荧光信号及低的扩增信号。
临床荧光PCR结果分析及常见问题临床荧光PCR结果分析及常见问题中国⼈民解放军三零⼆医院王海滨⼀、荧光 PCR 技术在临床诊、疗中的应⽤PCR 技术是于 1983 年由 Mullis 发明，后来传到我国，但是由于实验污染的问题， 1998 年卫⽣部取缔 PCR 实验⽅法在临床诊断中的应⽤。
荧光 PCR 出现后，污染减少很多，但近⼏年由于磁珠的应⽤，污染⼜再起。
2003 年， PCR 在 SARS 的早期诊断中⾮常有效，当时使⽤的是电泳法。
H1N1 甲型流感（ 2009 ）：荧光 PCR 技术作为确诊指标（ 755 份 / 天）。
疾病易感基因的研究（ SNP ）： CR1/ 丙型肝炎 IL-28B 。
疾病（肿瘤）易感基因的鉴定。
⼆、影响临床荧光 PCR 检测结果的因素（⼀）影响临床荧光 PCR 检测结果的常见因素1. 检验因素：实验室硬件、仪器、试剂、⼈员素质、技术⽔平、管理⽔平。
2. ⾮检验因素：标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的⼲扰物质、样本丢失！（⼆）加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发⽣规范标本前处理流程、制度化的重要性，建⽴不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可⾏路径（编号和项⽬错误等），查找标本丢失可能的环节。
加强本室新进⼯作⼈员流程培训，经常性进⾏临床医护的交流与培训。
（三）实验室分区分为：试剂配制、核酸提取、 PCR 扩增以及开放产物分析等区域。
分区⽬的：通过物理分割达到标本、试剂或使⽤器具等被沾染或掺⼊污染，标本间的交叉污染等。
分区要求：⾄少要有清洁的试剂配制和核酸制备区三、试剂配制（⼀）试剂配制室的设置与维护以空间内⽆核酸⽓溶胶为准！1 ．正压、清洁进风 ( 壁挂式空调 ) 。
试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品！定期清洁除霜！2 ．有效氯消毒液清洁实验室台⾯、地⾯。
3 ．移液器：使⽤前的清洁。
4 ．离⼼机等：每周定期⽊浆纸⼱擦拭，⽅法。
“⼀次性物品的使⽤ - 从 COBAS 的“浪费”中找到均衡！（⼆）试剂配制注意事项试剂配制实际是简单的问题，但是也是⾮常复杂的环节。
临床荧光PCR结果分析及常见问题冻存标本使用前要混匀离心后使用；不同类型标本：血清、血浆、细胞、组织、乳汁、痰液、尿液等；标本核酸提取前后的保存；提取后核酸的保存（稳定性）；核酸提取标本加入量与核酸得率的关系！ 1+1 与 2 的关系；指示剂的引入，可以降低差错率。
PPT10 显示的是指示剂在一管法的应用，可以看到上面蓝色的是核酸提取液，非常清楚，降低了差错。
四、荧光 PCR 扩增（一）实验室怎么建？独立区域、负压通风、物品专用：1. 实验室清洁用品的专用的重要性。
2. 扩增产物的处理（ PCR 管加盖、封膜、石蜡油），用两层封口袋包装后焚烧（如 PPT12 图）。
产物的处理必须由专业工作人员或经过培训的工作人员处理。
禁止未经培训的研究生、实习生和进修生进入区域对扩增产物进行操作。
3. 仪器清洁处理程序：载板区先用 70% 乙醇清洁。
该区所有垃圾需封闭运输并销毁。
4. 地面和空气处理原则。
（二）荧光 PCR 仪器如何选择？PCR 实验室的仪器非常多有几十种，应按照实验的要求不同来进行选择。
（三）荧光 PCR 仪器如何维护？荧光 PCR 仪器的功能模块分为三个：1. 温度模块包含最基本的升降温。
要保证温度模块的均一性，既不能有边缘效应，也不能有局部温度的影响。
2. 光学模块即测光系统， PCR 反应的过程中每一个循环都要测一次光，测光不论是照相还是扫描，都有一定的差别，光学模块的敏感性要高。
3. 软件模块荧光信号采集以后，要用软件模块来进行分析。
分析不但要人性化，而且还要准确，不能有故障。
（四）荧光 PCR 扩增循环数量的选择（ 60:50:40cycles ）COBASTAQMAN 用的是 60 个循环，早期是 40 个循环，近几年的荧光 PCR 试剂，循环数有所增加，如丙肝增加到 45 个循环，乙肝 42 个循环。
PPT16 显示的是实验室的图，扩增的循环数量是 40 个。
（五）质控品的设立 - 没有质控就没有质量保证对一个完整的实验，一定要注意有空白对照，阴性对照与临界对照，临界对照是对精密度的考核。
荧光定量PCR常见问题分析荧光定量PCR常见问题分析Q1．CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR产物太长。
一般采用80-150bp的产物长度。
Q2．无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。
一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。
一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。
可通过PAGE电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q3．标准曲线的线性关系不佳1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。
应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。
重新设计更好的引物和探针4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高Q4．阴性对照也出现明显的起飞1.应mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。
用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。
Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。
Q6．熔解曲线不止一个主峰1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
荧光实时定量PCR 结果分析问题荧光实时定量PCR结果分析问题2010-01-22 13：08Line Gene实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响目的探讨实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响。
方法用Line Gene FQD 33A型荧光定量PCR检测系统检测本院门诊和病房乙肝病人血清HBV DNA 77份，分别用最大二阶导数法和样点拟合法进行结果分析。
结果发现两种分析方法的总体相关性较好(r=0.978)。
但HBV DNA拷贝数含量<105时，两种模式的相关性差(r=0.706)，此时，最大二阶导数法得出的数值要比样点拟合法低(t=2.61,P<0.05)，且易出现假阴性结果。
结论虽然样点拟合法步骤较多，但其结果更可靠，因此进行结果分析时，建议使用样点拟合法。
而且当样本中HBV DNA拷贝数<105时只能使用样点拟合法进行结果分析。
实时荧光定量；聚合酶链反应；质量控制7.数据分析：(1)相对定量：使用△Ct法计算目的基因在不同组间的表达差异。
(2)绝对定量：将样品的Ct值代入标准曲线，以对目的基因进行定量。
(3)熔解曲线分析：确定产物特异性。
主要实验步骤：1.设计并合成Real time PCR引物。
2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR Green)的PCR反应优化。
3.客户样品RNA抽提。
a.实验对象为组织样品，取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，匀浆后抽提RNA。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106~1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，裂解后抽提RNA。
4.RNA质量检测a.紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。
螺旋课堂第一课－－荧光定量PCR 技术PCR 技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。
常规PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA 的精确copy 数等，如此，荧光定量PCR 技术便应运而生。
本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR 的理论知识，如荧光定量PCR 技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR 过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。
荧光基团第一章理论篇一、荧光定量PCR 技术发展史1993 年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR 方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR 技术的概念。
当时他使用了EB（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD 相机检测产生的荧光值，利用了PCR 反应中的数学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的，但由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的PCR 产物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。
1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct 值进行分析，荧光定量PCR 才很快得到大家的接受，并广为应用。
近年来，荧光定量PCR 技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。
