实验五叶绿体分离与观察28页PPT

叶绿体分离的方法
差速离心法
根据不同的转速和离心时间，使 不同大小的细胞器和叶绿体逐步 分离。
密度梯度离心法
在离心管中加入密度梯度介质， 使不同密度的细胞器和叶绿体在 离心时形成不同的沉降层。
叶绿体分离的实验步骤
植物材料的准备
细胞器的破碎与分 离
密度梯度离心
叶绿体的收集
叶绿体的保存
选取新鲜的植物叶片， 清洗干净，切成小块备 用。
荧光观察可以帮助研究植物在逆境条件下的生理反应，例如 干旱、高温、盐碱等环境压力对植物光合作用的影响。
在植物分子生物学研究中的应用
通过叶绿体分离和荧光观察，可以研究植物基因在叶绿体 中的表达和调控，进一步揭示植物的分子生物学机制。
荧光观察可以用于检测叶绿体中的蛋白质复合物和色素， 对于研究叶绿体生物合成和降解的分子机制具有重要意义 。
观察与记录
通过荧光显微镜观察样本的荧 光，并使用相机或成像系统记 录荧光图像。
结果分析
对记录的荧光图像进行分析， 提取所需的信息并进行解释。
04
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叶绿体分离与荧光观察的应用
在植物生理学研究中的应用
叶绿体是植物进行光合作用的主要细胞器，通过分离叶绿体 并观察其荧光，可以深入了解植物的光合作用机制和效率。
详细描述
叶绿体的生物合成过程是一个复杂的过程，可以分为三个阶 段：前体阶段、膜的合成阶段和基粒的组装阶段。在每个阶 段中，都有多种酶参与，以确保叶绿体的正常合成。
02
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叶绿体的分离技术
叶绿体分离的原理
01
叶绿体是植物细胞中的重要细胞 器，负责光合作用。
02
叶绿体分离的原理是基于叶绿体 在密度梯度离心时的沉降速度不 同，通过离心将叶绿体从其他细 胞器中分离出来。

5、将上清液在3000r/min下离心3min. 黑暗条件下，前质体形成白化体（etioplast），当植物转入光下生长时，白化体即转化为叶绿体。
心管，漏斗，脱脂棉，玻璃载片和盖片 5、将上清液在3000r/min下离心3min.
35mol/LNaCL溶液，用手术刀刮取一定的叶肉，将叶肉置于NaCL液滴中。
分离完整叶绿体有三个主要困难：
1）有细胞壁包裹。
2）叶绿体中由于淀粉积累成致
密颗粒,会在离心过程中使叶绿体 18 (C) Grana stacks and stroma lamellae; (D) Chloroplast
35mol/L氯化钠溶液 35mol/L氯化钠溶液
破碎。
3）匀浆过程中，液泡中储藏的 -thylakoid granum (类囊体叶绿体基粒): site for photosynthesis-light reaction
4、取滤液4ml在1 000r/min下离心4min；
有毒物质——酚类化合物会释放 -thylakoid granum (类囊体叶绿体基粒): site for photosynthesis-light reaction
35mol/LNaCL溶液，用手术刀刮取一定的叶肉，将叶肉置于NaCL液滴中。
Summary: Chloroplasts
• -contain double membranes (like nucleus and mitochondia)
• -thylakoid granum (类囊体叶绿体基 粒): site for photosynthesis-light reaction
• -Stroma(基质): site for photosynthesis-carbon reaction

➢ 实验中可以直接观察颜色的变化，也可用分光光度计对 还原量进行精确测定，该变化在4~5min内呈线性关系。
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三、实验材料
菠菜叶片
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四、设备与试剂
➢分光光度计，离心机，照光装置，试管， 移液管，烧杯，纱布，研钵等。
➢NaCl、Tris缓冲液、2.6-二氯吲哚叮酚
胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞 碎片，后用高速离心沉降叶绿体。
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2、希尔反应（Hill reaction）
2H2O +2A 光
叶绿体
2AH2+O2
➢ 离体的完整叶绿体，在合适的氧化剂（ 2.6-二氯吲哚 叮酚 ，一种蓝色染料） 存在下，当被照光时，可以使 水光解释放氧气，接受电子和 H+后被还原成无色。
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➢在沉淀中加入5ml NaCl，搅匀，得到叶 绿体悬浮液。
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2.希尔反应测定
管号 0.1MTris缓冲液 叶绿体
1
9.3ml
0.2ml
2
9.3ml
0.2ml
3
9.8ml
0.2ml
煮沸
—— 5min ——
2.6-二氯吲哚叮酚 0.5ml 0.5ml ——
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五、实验步骤
1. 提取叶绿体：
➢ 称鲜菠菜叶5g，加10 ml 0.35M NaCl、1ml Tris缓冲液、 石英砂，研磨。
➢ 匀浆用脱脂棉过滤。
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➢ 用天平将各组滤液调平。 ➢ 1000转/分离心5分钟，取上清液； ➢ 3000转/分离心5分钟，去除上清液，保留沉淀。

；.
3
实验：绿叶中色素的提取和分离
重点一：实验原理 (1)提取：叶绿体中的色素易溶于无水乙醇等有机溶剂中。 (2)分离：叶绿体中的各种色素在层析液中溶解度不同。
；.
4重点二：方法与步骤1．提取色素SiO2：使绿叶充分研磨。
CaCO3：防止研磨时色素受
到破坏。
过滤：单层尼龙布
；.
5
2．制备滤纸条
(4)画滤液细线：用力要均匀，快慢要适中。滤液细线要细、直，且干燥后重复 画一两次，使滤液细线既有较多的色素，又使各色素扩散的起点相同。
(5)色素分离：滤液细线不要触及层析液，否则滤液细线中的色素分子将溶解到 层析液中，滤纸条上得不到色素带。
；.
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叶 绿 素 的 提 取 与 分 离 实 验
；.
1
捕获光能的色素
绿叶中会有哪些种类的色素呢？ 它们分别是什么颜色的？ 各种色素在绿叶的含量相同吗？
；.
2
实验：绿叶中色素的提取与分离
实验材料和用具 (1)材料：新鲜的绿色叶片(如菠菜叶片) ; (2) 用 具 ： 无 水 乙 醇 ， 层 析 液 ， 二 氧 化 硅 ， 碳 酸 钙 ； 干 燥 的 定 性 滤 纸 ， 烧 杯 (100ml)，研钵，小玻璃漏斗，尼龙布，毛细吸管，剪刀，小试管，培养皿盖，药勺， 量筒(10ml)，天平。
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重点三：实验结果（现象）：
胡萝卜素 叶黄素 叶绿素a
叶绿素b 层析液
从上到下 胡黄 a b
滤液细线
；.
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捕获光能的色素
绿叶中会有哪些种类的色素呢？ 它们分别是什么颜色的？ 各种色素在绿叶的含量相同吗？
；.
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滤纸上色带的排列顺序如何？

观察：先低倍镜后高倍镜，线粒体被染成蓝绿色， 细胞质接近无色
实验步骤：
（2）线粒体的观察（人口腔上皮细胞）
在洁净的载玻片中央滴1滴健那绿染液。
用消毒牙签钝端刮自己漱净的口腔内侧壁 上轻轻地刮几下
把牙签附着有碎屑的一端，放在染液中涂 抹几下，5min后，盖上盖玻片，用吸水纸 吸去多余的染料
观察：先低倍镜后高倍镜，线粒体被染成蓝绿色， 细胞质接近无色
实验材料：人口腔上皮细胞和洋葱鳞片叶内表皮
实验步骤：
（一）叶绿体的观察
装片中的叶片 保持有水状态
在洁净的载玻片中央滴一滴清水，用镊子取 一片黑藻的叶，放在载玻片上的水滴中，盖 上盖玻片，制成临时装片。
将制作好的临时叶片装片放在显微镜下用低 倍镜观察，找到叶片细胞后换用高倍镜观察。
高倍显微镜下的黑藻叶绿体
高倍显微镜下的线粒体（已染色）
实验结束好习惯：
1.清洗载玻片，带走垃圾，将桌面物 品归位，摆放整齐。
2.降下载物台，将显微镜的光源 调到最暗，最后关闭显微镜后面 的电源开关。
3.填写显微镜使用情况。
实验目的：
➢ 使用高倍显微镜观察叶绿体、线粒体 的形态和分布
实验原理：
一、观察叶绿体
➢ 叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质中，呈绿色、扁平的 椭球形和球形 可在高倍显微镜下直接观察它的形态和分布
二、观察线粒体
线粒体普遍存在于植物细胞和动物细胞中，线粒体形态多 样，有短棒状、圆球状、线形、哑铃形等
健那绿染液 生活状态的线粒体
实验步骤：
（二）线粒体Байду номын сангаас观察（洋葱鳞片叶内表皮）
在洁净的载玻片中央滴1~2滴健那绿染液。
用刀片在洋葱鳞片叶内表皮细胞中画一“#” 字（边长约5mm)。沿着“#”字的一角撕取 一小块洋葱内表皮。 将撕取的洋葱鳞茎内表皮放到载玻片上， 叶肉面朝下漂浮于染液上。染色5min,盖上 盖玻片，用吸水纸吸去多余染液。

實驗六 葉綠體的分離與螢光觀察
【實驗目的】
1、通過植物細胞葉綠體的分離, 瞭解細胞器分離的原 理和方法。
2、掌握螢光顯微鏡的原理及使用方法。
【實驗原理】
細胞或組織經過破碎後製成勻漿，在等滲介質中進行差速 離心，利用細胞各組分品質大小、形狀和密度的不同，選擇不 同的離心力和離心時間，即可分離得到所需要的細胞器或大分 子組分。分離葉綠體在等滲的緩衝溶液中進行, 最好在0 ～ 4 ℃ 溫度下進行, 要迅速分離和觀察。
【實驗用品】
1、 器材 ：普通離心機、組織搗碎機、粗天平、螢光顯微鏡。
研缽、燒杯, 10ml刻度離心管 ，滴管，紗布，載片 和蓋玻片等。
2、 材料： 新鮮菠菜。
3、 試劑： 0.35mol/L氯化鈉溶液，
0.01%吖啶橙(acridine orange)。
【實驗方法】
（一）葉綠體的分離 1、選用生長健壯，最好是連續幾個晴天下生長的菠菜葉片 洗淨後去除中脈，然後放入 0 ～ 4 ℃冰箱或冰瓶中預冷。
2、用滴管吸取1滴葉綠體懸浮液於載玻片上，再滴加一滴0.01% 吖啶橙染液，蓋好蓋玻片後，吸水紙吸去玻片周圍多餘的溶 液，在螢光顯微鏡下觀察.
【實驗報告】
1、繪製普通光學顯微鏡下觀察的葉綠體的形態示意圖。 2、記錄螢光顯微鏡觀察的現象，分析結果。
【思考題】
1、分離葉綠體操作過程中應注意什麼？ 2、普通光學顯微鏡和螢光顯微鏡的原理及結構有何異同點？
2、取葉片經濾紙吸幹水後，稱取3g剪成碎片，於45 mL 0.35mol/L氯化鈉溶液中，置於研缽中，用手工快速研磨， (注意不要用力ห้องสมุดไป่ตู้猛，也不必研磨過細)。
3、研磨後將勻漿用6層新紗布過濾，濾液盛於燒杯中。
4、將5 mL濾液裝入預冷過的離心管，經天平平衡後，以 1000 rpm ，4 ℃離心 2 min，棄去沉澱。

2、将滤液收集到试管中后，为什么要用棉塞将 试管口塞严？
3、滤纸条一端为什么要剪去两角？
4、画滤液细线时应注意什么？
5、为什么不能让滤液细线触及层析液？
1.提取：绿叶中的色素都能溶解于有机溶剂无水乙 醇中，所以可以用无水乙醇提取绿叶中的色素。
2.分离：纸层析法
色素有多种，都能溶于层析液中，但不同色素在层析液 中的溶解度不同； 溶解度高→在滤纸上扩散快 溶解度低→在滤纸上扩散慢
碳酸钙作用：防止叶绿体中色素被破坏二氧化硅作用：使研磨更充分
1、滤纸条上色素带宽窄不同的原因有哪些？
不同种类的色素在绿叶中的含量不同，含量多的 在滤纸条上呈现的色素带宽，反之色素带窄。
2、试分析分离色素时色素带颜色过浅的原因。
(1)叶片颜色太浅。(2)叶片放置时间太久。 (3)研磨不充分。(4)未加CaCO3。 (5)加入提取液量太多。(6)研磨时间太长。
D．紫色
溶解度低→在滤纸上扩散慢
答：滤液细线上的色素会溶解到层析液中，从而无
用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀划出一条细线，
2、为什么研磨时要迅速？为什么研磨时加入碳酸钙和二氧化硅？
2、通过动手操作，体验成功的喜悦，培养乐于思考与创新的精神，逐步提升生物科学素养。
色素是有机物,只能溶于有机溶剂,如无水乙醇。
制备滤纸条
将干燥的定性滤纸剪成略小于试管长与
直径的滤纸条，将滤纸条一__端__剪__去__两__角_ ，在距离剪角一端1 cm处用__铅__笔_
画一__条__细__的__横__线___
画滤液细线：用毛细吸管吸取少量的滤液，沿铅笔线均
匀地
画_一__条__细__线____，待滤液干后，再画一两次
3、关于叶绿体中色素的提取和分离实验的

5）观察色素带
插滤纸条
第二十五页，共35页。
培养皿 层析液
实验结果
色素分离示意图
第二十六页，共35页。
橙黄 胡
黄黄 蓝绿 a
黄绿 b
溶解度大小： 胡>黄> a > b
含量： a > b >黄>胡
相邻两条色素带距离最远： 胡-黄
最近：
a-b
第二十七页，共35页。
1.叶绿素b缺失突变体，提取其色素并分离，色素带从下
某人做叶绿体中色素分离实验时，使用的是圆形滤纸，装置如下图。 滤液细线干燥后重复画2~3次 实验：绿叶中色素的提取和分离 使层析液在滤纸条上的扩散速度快 防止层析液在滤纸条的边缘处扩散过快
实验预留叶片变黄，有同学认为是叶绿素分解，有的认为是类胡萝卜素增多，请通过实验验证？ 加入SiO2、CaCO3、无水乙醇 1）层析液不能没及滤液细线 某同学获得水葫芦的粗产品，想知道其中是否含有其他色素，方法及步骤？
第三页，共35页。
二、实验原理
1、提取原理： 叶绿体色素溶解在有机溶剂不溶于水，
可用无水乙醇提取色素。
2、分离原理： 叶绿体中色素在层析液中的溶解度不同。 溶解度大随层析液在滤纸上扩散速度快 溶解度小随层析液在滤纸上扩散速度慢
第四页，共35页。
三、材料用具
第五页，共35页。
三、材料用具
二
氧碳
化酸层 硅钙析
叶绿体中从色素预在层析留液中叶的溶片解度不中同。取出等量的足量的、大小相近已变黄和未
变黄的叶片，进行色素提取和分离实验，观察并记录实
验结果，分析比较这两种叶片中色素的组成和含量，确
定结果
第二十八页，共35页。
某人做叶绿体中色素分离实验时，使用的是圆形 滤纸，装置如下图。实验结束时在圆形滤纸上形成 四个同心色素圆环，则最内圈所呈颜色为（ ）

D．秋冬的银杏落叶
解析 新鲜菠菜叶中的光合色素种类齐全、含量丰富、完整，
据图①可知，滤纸上的四条色素带完整，从上到下依次为胡萝
卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b。图②滤纸上的色素带不完
整，只有胡萝卜素、叶黄素。秋冬的银杏落叶呈黄色(或橙黄
色)，这是由于低温破坏了叶绿素所致，因此叶片中几乎不含叶
绿素。其他选项中的材料中都含有四种色素。
变体进行红光照射时，光吸收差异不显著；对正常叶片叶绿体
中的色素提取后，层析的结果自上而下依次是胡萝卜素、叶黄
素、叶绿素a和叶绿素b，故B正确。
答案 B
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(经典高考题)图中①代表新鲜菠菜叶的光合色素纸层析
结果，则图②所示结果最有可能来自 ( A．水培的洋葱叶
)。
D
B．生长的柳树幼叶
C．培养的衣藻
答案 B
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易错警示！ 1、实验中的注意事项及操作目的
过程
注意事项
操作目的
(1)
提 (2) 取 (3) 色 (4) 素 (5)
选新鲜绿色的叶片 研磨时加无水乙醇
加少量SiO2 加少量CaCO3
迅速、充分研磨
使滤液中色素含量高 溶解色素 研磨充分
保护色素，防止叶绿素被破坏
防止乙醇挥发，充分溶解色素
（1）收集到的滤液绿色过浅的原因分析: ①未加石英砂)(二氧化硅),研磨不充分. ②使用放置数天的菠菜叶,滤液色素(叶绿素太少). ③一次加入大量的无水乙醇,提取浓度太低(正确做 法:分次加入少量无水乙醇)。 ④未加碳酸钙或者加入过少，叶绿素被破坏。 （2）滤纸条色素带重叠 ①滤液细线不直 ②滤液细线过粗 （3）滤纸条无色素带： ①忘记画滤液细线 ②滤液细线接触到层析液，且时间较长，色素全部 溶解到层析液中。

荧光显微镜下演示
（二）菠菜叶徒手切片观察
用刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面（１片）置于载玻片上，加入0.35mol/L 氯化钠溶液１滴，加盖片轻压，光镜下观察叶绿体在表皮细胞和保卫细胞中的分布。
•.
•3
四、实验结果
普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍 镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
（一）叶绿体的分离与观察
1.取新嫩菠菜叶，洗净檫干、去梗，称20g，分批放入研钵。 2.加入0.35mol/L氯化钠溶液， 共20ml，研磨，制成匀浆； 3.将匀浆用６层纱布过滤于烧杯中； 4.取过滤液４ml，放入5ml离心管中，1000r/min离心２min； 5.取上清液转入另一5ml离心管中，3000r/min离心５min； 6.去上清，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核），加入0.35mol/L NaCl 溶液100ul悬浮沉 淀； 7.取含有叶绿体悬液１滴于载玻片上，加盖片，普通光镜下观察。
Differential centrifugation
High speed
Low speed
•.
•
二、实验用品
1.材料：新鲜菠菜 2.器材：离心机，研钵，漏斗，试管架，纱布，显微镜、载
玻片、盖玻片、镊子、50ml烧杯2个、10ml刻度离心管20 支 3.试剂: 0.35M 氯化钠溶液
•.
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三、实验步骤
五、实验报告
1. 简述：叶绿体的分离原理和方法； 2. 绘图：菠菜叶肉细胞的形态，显示叶绿体。
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