双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验 PPT课件

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共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
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Wide-field microscopy
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Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
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基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
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色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
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对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
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原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
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Confocal microscopy
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Confocal Principle

共聚焦显微镜应用
——细胞原位检测核酸
目录
▪ 概述 ▪ PI的特性 ▪ PI的应用 ▪ PI标记细胞的方法
概述
激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特征 及含量，即实现定位、定性及定量检测核酸。该方法常用于细胞核 定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色 体定位观察等。
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
PI标记细胞的方法
▪ 样品为活细胞
▪ 可直接向细胞外液中加人PI,使终浓度为1~15 μg/ml（根据细胞 种类及其密度而异），室温放置5~15min后，用激光扫描共聚焦 显微镜检测。
▪ 细胞膜完好的正常活细胞，PI不能染色；
▪ 膜不完整的细胞及死细胞则可检测到PI的红色荧光，此时观察到 的是细胞内DNA和RNA的总量。该项检测最好在短时间内完成，
Hale Waihona Puke PI应用▪ PI标记可以是活细胞也可以是固定的细胞
▪ 当标记活细胞样品时，目的在于检查细胞的膜完整性及其坏死情 况，常应用于检测膜损伤、细胞凋亡；
▪ 标记固定细胞时，目的一般是进行细胞核定位、显示细胞核或染 色体的形态、定量测定核酸等，常应用于检测细胞周期、细胞凋 亡、RNA和DNA在细胞内的分布及其含量变化、以及用作核酸显 色剂
谢谢聆听
未完待续
楚河汉界
小鼠肠道及其中的人类肠道 微生物，63x
重影的林
小鼠耳部血管与神经网， 10x
无定形
拟南芥的幼芽，40x
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。

感谢您的观看
图像采集与处理
采集参数设置
根据样本特性和实验目的，合理 设置图像采集的参数，如曝光时 间、增益等，以提高图像质量。
图像处理与分析
利用专业软件对采集到的图像进 行必要的处理和分析，如去噪、 增强对比度、测量荧光强度等。
数据导出与共享
将处理后的数据导出为通用的文 件格式，便于进一步的数据分析 和共享。
防止光漂白
在观察过程中，应尽量避免长时间 照射和频繁扫描，以减少荧光染料 的光漂白。
荧光探针的选择与使用
探针特异性
选择具有高特异性的荧光探针，以确 保标记的准确性和可靠性。
探针浓度与稳定性
探针混合使用
在某些情况下，可能需要将几种荧光 探针混合使用，此时应确保它们之间 不会发生相互干扰或淬灭现象。
根据实验需求，调整荧光探针的浓度， 并确保其在样本中的稳定性。
药理学研究中的应用
总结词
双光子和光谱扫描在药理学研究中具有重要价值，能够观察药物对细胞和组织的影响，有助于发现新 的药物作用机制和靶点。
详细描述
在药理学研究中，双光子和光谱扫描技术被广泛应用于观察药物对细胞和组织的影响。这些技术能够 实时监测药物对细胞代谢、能量代谢、蛋白质表达等方面的影响，帮助科学家们发现新的药物作用机 制和靶点，为新药研发提供有力支持。
04 技术挑战与未来展望
提高成像深度与分辨率
优化双光子吸收截面
通过提高双光子吸收截面，可以降低成像所需的激光功率，从而 减少光毒性。
开发新型光谱扫描技术
通过改进光谱扫描技术，可以实现更快速、更准确的图像采集，提 高分辨率。
优化光学元件
选用高数值孔径的物镜和低噪声的光电探测器，提高成像深度和分 辨率。
察细胞和组织的细微结构。

量、细胞膜流动性测量、膜电位测定) 细胞间隙连接的细胞间通讯
荧光探针的选择
合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实 验结果的保障。
(1)现有仪器所采用的激光器 (2)荧光探针的光稳定性和光漂白性 (3)荧光的定性或定量
定性:单波长激发探针 定量:双波长激发比率探针 (4)荧光探针的特异性和毒性。 (5)荧光探针适用的pH
LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获
得了美国的专利。
1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型
的扫描共聚焦显微镜。
1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦
2、球差：
由主轴上某一物点向光学系
统发出的单色圆锥形光束，经该 光学系列折射后， 不能聚焦成 一点,使成像模糊不清,形成一弥 散光斑(俗称模糊圈)，则此光学 系统的成像误差称为球差。
3、色差： 由白色物点向光学系统发出一束
白光，经该光学系列折射后，组成该 束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能会聚于同一点，即 白色物点不能结成白色像点，而结成 一彩色像斑的成像误差，称为色差。
*
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差
异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进
行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
*
许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进
入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）
结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过
质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非
特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可

表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
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2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源

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Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic frameworks
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RNH2
Facile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)

扫描速度与分辨率设置
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准

41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
激光共聚焦显微镜基ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ原理和实际操
作
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联

多模态成像技术结合
将激光共聚焦技术与其它成像技术（如超声、MRI等）相 结合，可以实现多模态、多尺度的成像，为科学研究提供 更多信息。
人工智能与大数据分析
结合人工智能和大数据分析技术，对激光共聚焦图像进行 深度挖掘和定量分析，提高实验结果的可靠性和可重复性 。
05
实验操作与注意事项
实验前的准备
实验材料
将激光束转换为扫描线，并控 制显微镜的X和Y轴移动。
检测器
用于检测荧光信号，并将信号 转换为电信号。
激光器
用于产生激发光，常用波长为 405nm、488nm、561nm和 640nm。
物镜
用于将激光束聚焦到样品上， 并收集荧光信号。
计算机
用于控制扫描头、物镜和检测 器，并收集和处理荧光信号。
性能指标
光漂白与光毒性
强激光束可能会引起荧光分子的光漂 白和光毒性，影响实验结果和细胞活 性。
未来发展与展望
提高成像速度
未来可以通过改进扫描技术和提高探测器性能来提高激光 共聚焦技术的成像速度，以适应更多动态观察的需求。
拓展应用领域
随着技术的进步和应用需求的增加，激光共聚焦技术有望 在更多领域得到应用，如医学诊断、药物研发等。
细胞生物学研究
细胞形态与结构研究
利用激光共聚焦技术观察细胞形态、细胞器结构以及细胞骨架等，有助于深入 了解细胞生物学特性。
细胞分子定位与相互作用
通过荧光标记技术，对特定分子进行定位和追踪，研究分子在细胞内的分布、 动态变化以及与其他分子的相互作用。
医学诊断与治疗
疾病诊断
利用激光共聚焦技术对活体组织进行无创检测，有助于早期发现和诊断肿瘤、炎 症等疾病。
显微镜设置
根据实验需求，设置 激光波长、扫描速度 、分辨率等参数。

科学、药理学和遗传学等领域中新的
有力研究工具。
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激光共聚焦显微镜在生物学中的应用
原位鉴定细胞或组织内生 活体细胞或组织功能的实
物大分子、观察细胞及亚 时动态监测
细胞形态结构
实时定量测定细胞内Ca2+变
检测核酸
化
检测蛋白质细胞定位
测定细胞内pH变化
检测细胞凋亡
检测膜电位变化
细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架 检测细胞间缝隙连接通讯 检测细胞内脂肪
另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其 它形式的钙也有作用。
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Projection
save “projection”
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图7～10. 7. 连续降温下生成 Ca2 + 荧光随时间变化的曲线 同时记录的荧光图像, 显示冬 小麦胞内荧光有相同的变化趋 势。8. 连续降温下生成Ca2 + 荧光随时间变化的曲线同时记 录的荧光图像, 显示春小麦胞 内荧光有相同的变化趋势。9. Fluo-3/ AM染色后,静息态下冬 小麦原生质体的三维重组图像。 10. Fluo-3/ AM染色后,静息态 下春小麦原生质体的三维重组 图像。
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
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目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 (2)加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水 培养16小时。

序列扫描的方法排除荧光串色
如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子： 使用 DAPI （蓝色）来标记细胞核、Cy2 （绿色）来标记 Na+/K+ ATPase、Alexa 568 phallodin （红色）来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时，DAPI 的信号串到了 Cy2 通道，Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后，所有的颜色都被清楚的分开，排除了荧光串色的影响。
紫外 蓝 绿
高压汞灯
被荧光探针染色的生物样本
激发
被标记结构的荧光光学图像
光学 成像
滤镜 分光
488nm 520nm
FITC
450nm 490nm
普通荧光显微镜是广视场显微镜
普通荧光显微镜是广视场显微镜
荧光相互干扰－－图象清晰度降低
激发的特异性差－－背景荧光高
显微镜＋
各种染色 标记技术
荧光标记技术
优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。 2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。 3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化
荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。
最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照： 首先观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光，在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。 如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。

放
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00

激光共聚焦显微镜原理和操作讲解
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。—