糖化血红蛋白高效液相色谱法

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酶法与高效液相色谱法测定糖化血红蛋白的结果比对分析

作者：黄艳萍 王星

来源：《医学信息》2016年第07期

摘要：目的 评估高效液相色谱法（HPLC）与酶化学法测定糖化血红蛋白的结果相关性和偏倚。方法 使用全自动糖化血红蛋白仪D-10采用高效液相色谱法和东芝TBA-120全自动生化分析仪以酶化学法分别测定40例EDTA-K2抗凝血液样本糖化血红蛋白，对结果进行分析比较；计算线性相关系数，直线回归方程和预期偏倚。结果 全自动糖化血红蛋白仪D-10高效液相色谱法的测定均值为7.78%，TBA-120全自动生化分析仪酶化学法测定均值为7.74%，线性回归方程为y=1.0349x-0.3111，r2=0.9923，无显著性差异（P>0.05），糖化血红蛋白可接受偏倚大于预期偏倚可信区间上限。结论 酶化学法与高效液相色谱法结果相关性良好，可满足临床要求。

关键词：高效液相色谱法；酶化学法；糖化血红蛋白

糖化血红蛋白Alc（HbAlc）是反映血液中葡萄糖水平的一个中长期指标，国际上通常将其做为糖尿病血糖控制的"金指标"[1]。目前我室采用高效液相色谱法和酶化学法，为给临床提供可靠地检测结果，比较两种检测方法测定HbAlc的差异，探讨其可比性，现参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准的EP9-A2文件[2]，对其进行比较分析。

1资料与方法

1.1一般资料 收集我院住院患者糖化血红蛋白标本40例，均为EDTA-K2抗凝全血。

1.2仪器和试剂 高效液相色谱法：全自动糖化血红蛋白仪D-10及配套试剂标准品；酶化学法：日本东芝TBA-120全自动生化分析仪，试剂和标准品为九强公司提供的HbAlc测定试剂；质控品为美国Bio-Rad公司生产，批号为33860.

1.3方法

1.3.1精密度实验 根据NCCLS EP5-A文件的要求进行精密度实验。采用美国Bio-Rad公司的中值质控和高值质控。批内不精密度实验：同一天将2份质控品连续定20次；批间不精密度实验：将2份质控品测定1次/d，连续测定20d。

·79·中国现代药物应用2019年6月第13卷第11期　Chin J Mod Drug Appl, Jun 2019, Vol. 13, No. 11

3　讨论

纤维蛋白原作为凝血因子之一, 易于定量检测, 目前已

常规应用于临床。根据伤后不同时间送至医院的胸腰椎A3、

A4型骨折患者, 分别在患者入院后检测凝血功能, 研究发现

随着创伤-抽血时间差增加其纤维蛋白原浓度增高, 创伤-

抽血时间在24 h后纤维蛋白原浓度趋于稳定。与既往文献

报道机体遭受严重创伤后在输液前抽血检测发现纤维蛋白原

浓度升高的结论不符［3］, 补液前后抽血化验可能是造成这一

差别的主要原因。胸腰椎A3、A4型骨折患者在遭受创伤后

伴失血、凝血因子的消耗与补充同时存在, 显然在创伤早期

其消耗速度大于机体补充速度, 而临床在输液前抽血检测却

发现该患者纤维蛋白原浓度升高, 这不能排除该患者创伤后

应激状态下血液浓缩这一因素。

本研究均是患者入院补液后不同时段抽血检测, 患者血

容量得到有效恢复, 发现在有效血容量恢复后创伤-抽血时

间差越短, 纤维蛋白原浓度降低, 此时再进行急诊手术, 必

然再次激活凝血系统, 凝血因子进一步消耗, 且随着术中补

液及失血, 凝血因子浓度进一步降低, 这可能导致术中凝血

时间会延长, 进而导致手术失血增多。因此机体遭受创伤后

纤维蛋白原浓度“正常”或“升高”并不能客观反映患者急

诊手术期间的凝血能力。

临床上对急诊手术的定义分歧较大, 从8 h~4 d均实施

过急诊手术［4］, 手术安全性、有效性等因素通常是划分的依

据, 而目前争议较大, 仍尚无定论［5］。本研究结果显示, 急

诊组患者纤维蛋白原水平低于择期组, 创伤-抽血时间差、

创伤-手术时间差短于择期组, 术中出血量、术后引流量

多于择期组, 手术时间长于择期组, 比较差异有统计学意义

(P<0.05)。

手术失血量关乎手术安全性, 不可否认影响手术失血量

的因素是多方面的, 包括手术入路、手术时机、手术方式、

糖化血红蛋白方法学

离子交换色谱法是一种常用的测定糖化血红蛋白的方法。其原理是利用离子交换色谱材料，如糖化纤维素柱或离子交换树脂柱，将血红蛋白与其他蛋白质分离。然后通过光度计测定柱床流出液中的吸光度值，从而计算出糖化血红蛋白的含量。常用的柱床流动相是碳酸盐缓冲液和甲醇的混合物。在色谱过程中，通过改变流动相的组成，可以将糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白分离出来。离子交换色谱法测定糖化血红蛋白的优点是操作简单、结果准确可靠，但缺点是分离过程相对较慢。

高效液相色谱法是一种新型的糖化血红蛋白测定方法，其原理是利用高效液相色谱技术，将血红蛋白中的糖化部分与非糖化部分分离，并通过检测器测定其吸光度值。高效液相色谱法的优点是分离速度快，对样品要求低，仪器自动化程度高。通过优化柱床流动相的组成和流速等条件，可以实现对糖化血红蛋白的高灵敏度测定。常用的柱床流动相是缓冲液和有机溶剂的混合物，通过改变混合物中的有机溶剂浓度和pH值，可以实现样品中糖化血红蛋白的分离。高效液相色谱法测定糖化血红蛋白的缺点是操作复杂、设备成本高，需要专业的操作技术。

除了离子交换色谱法和高效液相色谱法，还有其他一些测定糖化血红蛋白的方法，如酶联免疫测定法、免疫扩散法等。这些方法基于血红蛋白与糖化血红蛋白之间的抗原性差异，通过特定抗体的反应进行测定。这些方法操作简单、结果迅速，但对设备要求较高，且结果可能受到其他物质的干扰。

总之，糖化血红蛋白是评价糖尿病患者血糖控制情况的重要指标。离子交换色谱法和高效液相色谱法是常用的测定糖化血红蛋白的方法。此外，还有其他一些方法，如酶联免疫测定法、免疫扩散法等。不同的方法各有优缺点，选择合适的方法应根据实际需要和实验条件进行考虑。

糖化血红蛋白分析仪用洗脱液（高效液相色谱法）

适用范围：本试剂与Bio-Rad Laboratoreies，Inc.公司生产的D-10型血红蛋白测试系统配套使用，用于体外定量检测人全血样本中糖化血红蛋白（HbA1c）占血红蛋白的百分含量。

1.1包装规格

400人份/盒

2.1 外观

溶液应澄清透明、无可见杂质，标签标识字迹清晰、内容完整。

2.2 装量

应不少于标示值。

2.3 pH值

清洗缓冲液 1：5.85～6.25

清洗缓冲液 2：6.50～6.90

2.4 准确度

用同一个批号的产品检测人血红蛋白溶液中糖化血红蛋白国家标准物质（编号为GBW09181、GBW09182、GBW09183），分别平行测定3次，测量结果的相对偏差应在±10%范围内。

2.5 重复性

用同一个批号产品检测糖化血红蛋白质控物：水平1（4.0%~6.8%）、水平2（8.0%~12.0%），分别平行检测10次，检测结果符合相应的赋值范围要求，变异系数（CV%）≤5%。

2.6 批间相对极差

取3个批号的产品，检测糖化血红蛋白质控物：水平1（4.0%~6.8%）、水平2（8.0%~12.0%），每批产品平行检测10次，批间相对极差应≤5%。

2.7 线性

在线性范围[3.8%，18.5%]的检测区间内，相关系数r应≥0.990，各浓度点测量结果相对偏差应在±10%范围内。

2.8 稳定性

在10℃~30℃的条件下有效期12个月。过期后三个月内检测2.1、2.3、2.4、2.5和2.7项，检测结果应达到相应的要求。