高效液相色谱法测定血清葡萄糖
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高效液相色谱法测定血清葡萄糖
陈忠余;张天娇;张传宝;张江涛;周伟燕;闫颖;陈文祥
【摘 要】目的 建立一种测定血清葡萄糖(glucose,Glu)的高效液相色谱法(HPLC),探讨其能否作为血清Glu测定的参考方法.方法 以D-半乳糖(D-galactose)为内标物,用无水乙醇沉淀、去除血清中的蛋白质,在pH9.1条件下与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)反应,用HPLC测定血清Glu衍生产物、D-半乳糖衍生产物,用标准曲线法定量；对建立的方法进行方法学评价.结果 本法测定血清Glu的批内变异系数(CV)为0.33％～ 0.67％,平均0.51％；批间CV为0.02％～ 0.85％,平均0.38％；总CV为0.47％～ 1.03％,平均0.68％.回收率为98.22％ ～ 101.96％.分析Glu的参考物质SRM 965a,测定结果与认定值的偏差为-0.928％～0.347％,平均偏差为- 0.072％.结论初步建立了测定血清Glu的HPLC法；该法准确、精密,有望作为血清Glu测定的候选参考方法.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2011(029)009
【总页数】3页(P660-662)
【关键词】葡萄糖;高效液相色谱;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮
【作 者】陈忠余;张天娇;张传宝;张江涛;周伟燕;闫颖;陈文祥
【作者单位】重庆市第一人民医院检验科,重庆400011;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730
【正文语种】中 文
目前国际上测定血清Glu的参考方法有德国临床化学会(German Federation of
Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，DGKL)[1]、美国国家标准和技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)[2]和比利时根特大学[3]的同位素稀释气相色谱质谱(isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry，ID-GC/MS)法、美国疾病控制中心[4](Centers for
Disease Control，CDC)和日本临床化学会(Japanese Society of Clinical
Chemistry，JSCC)的己糖激酶法。我国卫生部临床检验中心也建立了血Glu测定的候选参考方法——同位素稀释液相色谱串联质谱法(isotope dilution liquid
chromatography-tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)。本文介绍了一种前处理过程简单、精密度和准确度较高的测定血清Glu的高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)法。
1 材料和方法
1.1 HPLC法测定血清Glu原理 本色谱法用内标法定量，测定原理是Glu与内标物混匀后，用乙醇沉淀蛋白，用衍生试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)对Glu、内标物进行柱前衍生(见图1)，生成单一的、具有强紫外吸收的化合物，用液相色谱分析仪分离、检测衍生产物。
注：1,PMP；2,Glu；3，D-半乳糖。图1 Glu衍生化反应过程
1.2 试剂与仪器 Glu的NIST标准物质SRM 917b和SRM 965a，认定纯度均为(99.7±0.2)%，分别用于配制Glu的标准溶液及评价HPLC法检测Glu的准确性。D-甘露糖、D-半乳糖和D-果糖购自北京化学试剂公司，纯度均为99%；D-阿洛糖、D-阿卓糖和D-古洛糖和PMP购自美国Sigma公司，纯度均为99%；无水乙醇、乙腈、氯仿等有机溶剂购自美国Fisher公司，均为色谱纯。配备紫外-可见光检测器的Agilent 1200高效液相色谱仪购自美国Agilent公司；MicroLab
500稀释器购自美国Hamilton公司；涡旋振荡器和离心机为美国Sigma公司产品。
1.3 Glu标准溶液的制备 称取适量SRM 917b，去离子水溶解，制备1.39、2.78、5.55、8.33、11.10、13.88 mmol/L的Glu标准溶液。
1.4 内标物的优选
1.4.1 候选内标物溶液的配制 称取适量D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-古洛糖，分别用去离子水溶解，加入1 g/L叠氮钠防腐剂，分别配制5种浓度为0.72 g/L的候选内标物溶液，于-20 ℃保存。
1.4.2 衍生化 取0.1 mL 5.55 mmol/L的Glu标准溶液，分别与0.1 mL候选内标物溶液、0.8 mL无水乙醇混合，取0.1 mL混合溶液置于2 mL 安瓿中。加入0.1
mL PMP(250 mmol/L)-氨水溶液(400 mmol/L)于安瓿，调pH值至9.1。密封安瓿，用旋涡振荡器混匀，于70 ℃反应30 min后冷却至室温，加入1 mol/L乙酸溶液0.2 mL、去离子水1 mL混匀。加入氯仿1 mL，振荡萃取5 min后，以1
500×g离心5 min，将水相转移至另一安瓿中用于高效液相色谱分析。
1.4.3 内标物的选择 用1.5中的高效液相色谱分析条件，测定各个内标候选物的衍生产物，考察与Glu衍生产物的分离度、保留时间、重复进样Glu/内标物峰面积比的精密度，选择合适的内标。
1.5 样品处理 5个Glu浓度不同的人新鲜血清(由卫生部临床检验中心提供)，样品号为A～E，于-70 ℃保存。样品的衍生化同内标物的衍生化。
1.6 色谱分析和计算 1.6.1 液相色谱条件 Symmetry C18色谱柱(2.0 mm×150 mm，粒径3.5 μm，美国Waters公司)；流动相为10 mmol/L乙酸铵-乙腈溶液(78∶22)，pH为5.26，流速为0.3 mL/min，检测波长为245 nm，进样量为5 μL。
1.6.2 色谱分析和计算 将样品与Glu标准溶液按浓度由低至高穿插排列后测定1次，再按反向顺序测定1次，检测结果的均值为有效数据。将标准溶液中Glu、D-半乳糖的峰面积比与相对应Glu浓度进行线性回归，得到回归方程，将样品的Glu/内标物的峰面积比代入该回归方程，计算得到样品中Glu含量。
1.7 统计学分析 用Excel 2007软件进行。
2 实验与结果
2.1 内标物的选择 考察各种糖与PMP的反应性、保留时间、分离度等因素，结果表明阿洛糖和D-半乳糖较为适宜用作内标。D-半乳糖与Glu为同分异构体，在衍生、液相分析等过程中与Glu具有几乎一致的理化行为，而纯品阿洛糖价格较高，半乳糖价格低廉，因此，半乳糖是较为理想的内标。
2.2 色谱条件的选择 通过实验发现色谱柱的种类、流动相的组成、pH值、缓冲盐的浓度都会影响Glu与PMP衍生产物的色谱行为。pH值越低，分离度越好但洗脱时间延长。缓冲盐的浓度越高，分离越好。综合考虑分离度和保留时间等因素，最终确定色谱条件：色谱柱为Symmetry C18柱,流动相为乙酸铵(10 mmol/L)-乙腈溶液(78∶22)，pH为5.26，流速为0.3 mL/min，检测波长为245 nm，进样量为5 μL，分析时间为15 min。
2.3 高效液相色谱分析Glu的色谱图 见图2。
注：1,PMP；2,Glu；3，D-半乳糖。图2 HPLC法测定血清Glu色谱图
2.4 方法学评价
2.4.1 精密度试验 用HPLC法测定5种不同浓度Glu的血清(A～E)3次，每次重复测定2份，结果5种浓度(3.67～6.36 mmol/L)血清Glu测定的批内变异系数(CV)的范围为0.33%～0.67%，平均CV为0.51%；批间CV的范围为0.02%～0.85%，平均CV为0.38%；总CV的范围为0.47%～1.03%，平均CV为0.68%。
2.4.2 准确度试验 用本法测定4个水平的SRM 965a，各测定2次，结果见表1。本法测定各水平参考物质的结果与认定值的平均偏差为-0.072%(范围-0.928%～+0.347%)。
表1 HPLC法测参考物质的结果SRM965a标准血清认定值测定结果偏差(%)水平11．918±0．0201．9250．35水平24．357±0．0484．3570．004水平36．777±0．0736．7970．29水平416．240±0．19016．089-0．93
2.4.3 回收试验 以血清A(Glu浓度为3.67 mmol/L)为研究对象，分别加入1.41
mmol/L和2.26 mmol/L的Glu标准物质SRM 917b溶液，用本法测定加入SRM 917b前后血清Glu浓度，每批每种浓度的血清重复测定2份，共测定4批，计算本法的回收率。两种浓度血清Glu的平均回收率分别为99.61%(范围98.20%～100.70%)和100.54%(范围99.30%～102.00%)。
2.4.4 干扰物分析 文献报道[5], 血清中存在的六碳单糖除Glu外主要为甘露糖、果糖和半乳糖，应考虑这几种单糖对测定的影响。血清中甘露糖和果糖浓度稍高，约为血清Glu浓度的1%，而D-半乳糖浓度则非常低，约为血清Glu浓度的0.25%，此干扰可以忽略。本法研究中样品经过衍生处理后，果糖为酮糖类单糖，不与PMP反应；甘露糖的保留时间约为5 min，对测定没有影响。见图2。
注：1，甘露糖;2，Glu;3，D-半乳糖。图3 HPLC分析甘露糖、Glu和半乳糖色谱图
2.4.5 HPLC法与ID-LC/MS/MS法比对 本法与本实验室已建立的ID-LC/MS/MS法测定血清B、D和E中的Glu，所得结果列于表2。HPLC法与ID-LC/MS/MS法测定结果的偏差<1% 。
表2 HPLC法与ID-LC/MS/MS法测血清Glu的结果(n=6)血清LC/MS/MS法(mmol/L)HPLC法(mmol/L)偏差(%)A3．683．67-0．41B4．224．250．73E6．326．360．57
3 讨论
将同位素稀释质谱法与HPLC法综合使用，能够发挥较大作用，本研究基于此出发点，研究建立了血清Glu测定的HPLC法。PMP作为衍生剂[6]，对Glu及其内标进行化学结构改造，改善了Glu在色谱上的保留，提高了方法的灵敏度。反应系统中过量的PMP可经2次氯仿抽提充分洗去。考虑到PMP的保留时间较短，少量PMP的存在对Glu的测定没有影响，我们简化了操作，仅用氯仿提取1次，缩短了样品处理时间，以便于大样本量的操作。用本法测定Glu，样品制备的时间仅需约1 h。
总之，本研究以半乳糖为内标，建立了血清Glu测定的HPLC法。该方法准确、精密，操作简便、快速，可望作为血清Glu测定的候选参考方法。
