超滤法提取纳豆激酶的技术参数优化
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纳豆激酶高产菌株筛选及发酵条件优化
1000 800 600 400 200 0 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8
3.5.4
图 3 碳源对纳豆激酶活性的影响 Fig 3 The effect of nattokinase activity by carbon source
从图 3 可知，以甘油和蔗糖为碳源时，纳豆激酶 活性相对较高。同时考虑工业生产成本问题，故选用 蔗糖作为培养碳源。 3.5.2 氮源选择 由于本菌从大豆发酵制品中分离得到，所以选择 2 %的大豆、豆粕及蛋白酶处理的大豆及豆粕作为氮 源，24 h 后比较活性变化，结果见图 4。由结果可知， 用豆粕发酵时纳豆激酶活性相对较高。
图 6 初始 pH 对纳豆激酶活性的影响 Fig.6 The effect of nattokinase activity by pH
3.5.5 单因素正交实验 对碳源（蔗糖） 、氮源（豆粕） 、温度、起始 pH 4 四个因素，设计正交实验表 L9(3 )(见表 1)。 利用 DPS 数据处理软件对正交试验结果进行正 交试验方差分析，比较各列的极差 R 值，可以看出 RA>RB>RC>RD，即在实验所设定的各因素中，碳源对 纳豆激酶活性影响最大， 次是氮源和发酵温度， 而 pH 从而得到该 的影响较小， 最佳因素组合为 A2B2C2D2。 优化培养基（ZD）由 2 %蔗糖和 2 %豆粕组成，发酵 温度为 37 ℃，起始 pH 为 7.0。
Abstract: Fifteen Nattokinase-producing strains separated from Japanese food-natto were investigated in this study. The strain N-15 was selected from the examined striains for its high level of nattokinase-producing activity (900IU/mL). The fermention conditions of the strain N-15 for the nattokinase production were optimized by single factor and orthogonal tests. It was found that the optimal soybean residue content, sucrose content, incubation temperature and the original pH value were 20 %, 2 %, 37 ℃and 7.0, respectively. Under the optimized fermentation conditions, Nattokinase was produced with a high activity level of 1033 IU/mL. Key words: nattokinase; Bacillus natto; screened selection; optimization
3.5.4
图 3 碳源对纳豆激酶活性的影响 Fig 3 The effect of nattokinase activity by carbon source
从图 3 可知，以甘油和蔗糖为碳源时，纳豆激酶 活性相对较高。同时考虑工业生产成本问题，故选用 蔗糖作为培养碳源。 3.5.2 氮源选择 由于本菌从大豆发酵制品中分离得到，所以选择 2 %的大豆、豆粕及蛋白酶处理的大豆及豆粕作为氮 源，24 h 后比较活性变化，结果见图 4。由结果可知， 用豆粕发酵时纳豆激酶活性相对较高。
图 6 初始 pH 对纳豆激酶活性的影响 Fig.6 The effect of nattokinase activity by pH
3.5.5 单因素正交实验 对碳源（蔗糖） 、氮源（豆粕） 、温度、起始 pH 4 四个因素，设计正交实验表 L9(3 )(见表 1)。 利用 DPS 数据处理软件对正交试验结果进行正 交试验方差分析，比较各列的极差 R 值，可以看出 RA>RB>RC>RD，即在实验所设定的各因素中，碳源对 纳豆激酶活性影响最大， 次是氮源和发酵温度， 而 pH 从而得到该 的影响较小， 最佳因素组合为 A2B2C2D2。 优化培养基（ZD）由 2 %蔗糖和 2 %豆粕组成，发酵 温度为 37 ℃，起始 pH 为 7.0。
Abstract: Fifteen Nattokinase-producing strains separated from Japanese food-natto were investigated in this study. The strain N-15 was selected from the examined striains for its high level of nattokinase-producing activity (900IU/mL). The fermention conditions of the strain N-15 for the nattokinase production were optimized by single factor and orthogonal tests. It was found that the optimal soybean residue content, sucrose content, incubation temperature and the original pH value were 20 %, 2 %, 37 ℃and 7.0, respectively. Under the optimized fermentation conditions, Nattokinase was produced with a high activity level of 1033 IU/mL. Key words: nattokinase; Bacillus natto; screened selection; optimization
纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究
纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究董志奎,杨 超,尹宗宁,李 萌(四川大学华西药学院,四川成都610041) 摘 要:目的研究纳豆激酶分离纯化工艺及酶学性质。
方法纳豆激酶发酵液的粗提物经Superdex 75凝胶色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE )分离纯化,采用T AME 法测定酶的活性,通过S DS 2PAGE 对纯化结果进行了检验。
结果S DS 2PAGE 中显示单一色带,相对分子质量28000,以T AME 为底物时纳豆激酶的米氏常数(K m )为35.47mm ol/L ,最适宜的温度37℃,最适宜pH 为8.6。
结论该分离纯化方法可以得到较纯的纳豆激酶。
关键词:纳豆激酶;分离纯化;酶学性质;米氏常数(K m ) 中图分类号:Q55;T Q464.8 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0520298204Study on puri fication and enzyme kinetics of nattokinaseDONG Zhi 2kui ,Y ANG Chao ,YI N Z ong 2ning ,LI Meng(West China School o f Pharmacy ,Sichuan Univer sity ,Chengdu 610041,China ) Abstract :Purpose T o study the techniques of the separation and purification of the nattokinase and itscharacterization.Methods The natuokinase extract was purified by gel 2chromatography (Superdex75)and poly 2acrylamide gel electrophoresis (PAGE ).The purified nattokinase was tested by S DS 2PAGE ,and the T AME method was used to determine the activity of the enzyme.R esults There was only one strip in the S DS 2PAGE atlas ,and the m olecular weight of nattokinase was 28kDa.The Michaelis constant (K m )of nattokinase was 35.47mm ol/L when T AME was the substrate ,and the best reaction tem perature was 37℃and the best reac 2tion pH was 8.0.Conclusion Purified nattokinase can be obtained by the the techniques of the separation and purification.K ey w ords :nattokinase ;separation and purification ;characterization ;michaelis constant (K m )收稿日期:2009203225基金项目:国家自然科学基金项目(30371696)作者简介:董志奎(19842),男,药剂专业在读硕士研究生;尹宗宁(19642),女,通信作者,副教授,T el :028*********,E 2mail :yzn @scu. 。
纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用
纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用引言：纳豆激酶(Nattokinase)是一种来源于传统日本食品纳豆中的蛋白酶，具有多种生物活性，如溶栓、抗凝血、抗炎等。
在过去的几十年里，人们对纳豆激酶的研究逐渐增多。
本文将重点讨论纳豆激酶的发酵过程、纯化条件的优化以及其在医药和食品工业中的应用。
纳豆激酶发酵的条件优化：纳豆激酶产生菌株的筛选和培养基的优化是纳豆激酶发酵的首要步骤。
选择产纳豆激酶能力较高的菌株，并通过基因工程方法来提高其产酶能力，可以大大增加纳豆激酶的生产效率。
培养基的研究也是优化纳豆激酶发酵条件的重要环节。
适当调整培养基的pH值、碳源、氮源和有机酸等参数，可以显著提高纳豆激酶的产量。
纳豆激酶的纯化方法：纳豆激酶是一种具有较高分子量的蛋白酶，因此采用离子交换、凝胶层析、亲和层析等技术进行纯化是常见的方法。
离子交换层析是利用蛋白质与离子交换柱上的固定相之间的静电作用进行分离，该方法具有简便、高效的特点。
凝胶层析则是基于蛋白质在固定相的排阻效应分离的技术，可以纯化目标蛋白酶。
亲和层析则是利用目标蛋白酶与亲和基质之间的特异结合来纯化蛋白质。
综合应用这些方法，可以得到较纯的纳豆激酶。
纳豆激酶的应用前景：纳豆激酶具有多种生物活性，因此在医药、保健品和食品工业中具有广阔的市场前景。
首先，在医药领域，纳豆激酶被广泛应用于溶栓治疗，可以降低血栓形成的风险。
同时，纳豆激酶还具有抗凝血、抗炎、降低血脂等功能，因此也可以用于治疗心血管疾病。
其次，纳豆激酶可以作为保健品，用于改善心脑血管健康、抗衰老和增强免疫等作用。
此外，纳豆激酶还可以用作食品添加剂，以增加食品的营养价值和保鲜效果。
结论：纳豆激酶发酵、纯化条件的优化以及其在医药和食品工业中的应用有着巨大的潜力。
通过选择高产纳豆激酶菌株和优化培养基条件，可以提高纳豆激酶的产量。
同时，离子交换、凝胶层析和亲和层析等技术可以有效纯化纳豆激酶。
纳豆激酶高活性菌株的筛选及其液体发酵条件的优化
Ｚ Ｎ ｅ ｇ Ｉ ｉ ，Ａ ｉｇ， Ｅ Ｃ ｅｇ ｊｎ ＨＡ Ｇ Ｆ ｎ Ｎ Ｊ Ｎ Ｙ ｎ 。 ，Ｊ ｅ ＸＩ ｈ ｎ －ｕ （．ｕｈ ｕＣ ｌ ｇ ｆ ｌｕｔａ Ｔ ｃ ｎ ｌ ｙＸ ｚｏ ２ ０Ｊ ｎ ｓ，ｈｎ ；．ｏ ｅｅｏ Ｆ ｏ ｃ ｎ ｅａ ｄ １ ｚ ｏ ｏ ｅｅｏ ｄ ｓ ｉ ｅｈ ｏ ｇ，ｕ ｈｕ２ １４ ，ａ ｇｕ ｉａ Ｃ ｌ ｇ ｔ ｏｄＳ ｉ ｃ ｎ Ｘ ｌ ｈ ｒｌ ｏ １ ｉ Ｃ ２ ｌ 。 ｅ
Ｓ ＣＲＥＥＮＩ ＮＧ ＯＦ ＴＨＥ ＳＩ ＲＡＩ ＷＩ ’ＡＣＴＩ ＴＹ ＡＮＤ Ｅ ＶＩ ０ ｒ ＭＩ Ｉ ＺＡＴＩ） ＯＦ Ｉ Ｓ （Ｎ Ｆ
ＬＱ Ｉ Ｅ ＭＥ Ｔ ＴＯ Ｏ ＤＴＯ Ｓ Ｉ Ｕ ＤＦ Ｒ Ｎ Ａ ＩＮ Ｃ Ｎ ＩＩ Ｎ
纳豆激 酶（ａｏｉ ｓ， Ｎ ｔｋ ａｅ 简称 Ｎ ） 日 的传 统 ｔ ｎ Ｋ足 本 食品——纳 ￣（ ｔ ） ｎ ｔ 在发酵过 程 中产牛 的 ， ａｏ 是一 种 由纳豆芽孢杆菌（ａｉ ｓ ｎｔ） Ｂ ｃｌ ａｏ 生 的具有纤溶 活 ｌ ｕ ｔｉ 性 的丝氨酸蛋【酶。１８ 年 日 Ｌ ｌ ９７ 本学者 Ｄ． ｒ 首次 ｒＨ ｉ Ｓｎ 在纳豆 中分离 ｍ纳 激酶 ， 并做 了系统研究… ．目 内外 的研究结果表明 ， Ｋ可自 效地分解 血栓 的主 Ｎ ’ 要成分——纤维蛋 白及其它 ｆ Ｈ Ｄ Ｖ ｌＬｕ Ｌｓ ｛ — — ａ ｅ— ｙ一 ｊ ｌ — Ｐ Ａ等合成的基质， 而具有同血浆纤维 白酶相似 Ｎ 的特异性 ．由于其具有无毒无副作用 ， 内半衰 体 期长 ，成本低廉等其他溶栓剂无法比拟的优点 ， 傲 有可能 开发成为新一代理想的预防和治疗 心脑 血 管疾病的生化药物 。 据 ＷＨ Ｏ统计 ， 全球血栓患者 １ ０ 万 ， ０ 每年仅 ５ 我国就有近 １０ ５ 万人步 于栓塞性心脑血管疾病 ， Ｅ 全 球潜在的市场约 ２ 亿美元 ０ 。本实验从纳 ｌ分离 ｆ ｊ 出一株产纳豆激酶活力 高的菌株 ， 并进行该菌株液 体发酵 的产酶条件 的优化 ， 为新型保健食品 、 物 药 的产业化提供 了理论依据和技术支持 。 １ 材料与方法 ｌ － 】试剂
Ｓ ＣＲＥＥＮＩ ＮＧ ＯＦ ＴＨＥ ＳＩ ＲＡＩ ＷＩ ’ＡＣＴＩ ＴＹ ＡＮＤ Ｅ ＶＩ ０ ｒ ＭＩ Ｉ ＺＡＴＩ） ＯＦ Ｉ Ｓ （Ｎ Ｆ
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纳豆激 酶（ａｏｉ ｓ， Ｎ ｔｋ ａｅ 简称 Ｎ ） 日 的传 统 ｔ ｎ Ｋ足 本 食品——纳 ￣（ ｔ ） ｎ ｔ 在发酵过 程 中产牛 的 ， ａｏ 是一 种 由纳豆芽孢杆菌（ａｉ ｓ ｎｔ） Ｂ ｃｌ ａｏ 生 的具有纤溶 活 ｌ ｕ ｔｉ 性 的丝氨酸蛋【酶。１８ 年 日 Ｌ ｌ ９７ 本学者 Ｄ． ｒ 首次 ｒＨ ｉ Ｓｎ 在纳豆 中分离 ｍ纳 激酶 ， 并做 了系统研究… ．目 内外 的研究结果表明 ， Ｋ可自 效地分解 血栓 的主 Ｎ ’ 要成分——纤维蛋 白及其它 ｆ Ｈ Ｄ Ｖ ｌＬｕ Ｌｓ ｛ — — ａ ｅ— ｙ一 ｊ ｌ — Ｐ Ａ等合成的基质， 而具有同血浆纤维 白酶相似 Ｎ 的特异性 ．由于其具有无毒无副作用 ， 内半衰 体 期长 ，成本低廉等其他溶栓剂无法比拟的优点 ， 傲 有可能 开发成为新一代理想的预防和治疗 心脑 血 管疾病的生化药物 。 据 ＷＨ Ｏ统计 ， 全球血栓患者 １ ０ 万 ， ０ 每年仅 ５ 我国就有近 １０ ５ 万人步 于栓塞性心脑血管疾病 ， Ｅ 全 球潜在的市场约 ２ 亿美元 ０ 。本实验从纳 ｌ分离 ｆ ｊ 出一株产纳豆激酶活力 高的菌株 ， 并进行该菌株液 体发酵 的产酶条件 的优化 ， 为新型保健食品 、 物 药 的产业化提供 了理论依据和技术支持 。 １ 材料与方法 ｌ － 】试剂
纳豆激酶论文：纳豆激酶地优化、提取分离纯化及基因克隆
纳豆激酶论文：纳豆激酶的优化、提取分离纯化及基因克隆【中文摘要】心脑血管性疾病,具有“发病率高、致残率高、死亡率高、并发症多”等特性。
2005年,世界卫生组织(WHO)调查表明,全世界每年约有1700万人死于心脑血管疾病。
并且随着人类生活水平的提高以及生活压力的增加,而呈现年轻化的趋势,而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病。
所以,血栓的防治已是当务之急。
虽然传统药物在心脑血管及血栓栓塞性疾病防治上疗效显著,但毒副作用严重;而传统大豆发酵食品不仅效果显著且安全无毒,可作为一种具有开发和利用价值的功能性预防保健食品。
据文献记载,纳豆源于中国的豆豉,通过佛教由中国传入日本,日本人均寿命长的原因除了与较为优良的自然环境有关外,更重要的是其膳食结构中,发酵食品特别是消费量最大的纳豆,是日本人长寿的秘方,视为国宝级食品。
寺院喜食大豆是因为其蛋白质含量高达35.3%,而由纳豆菌产出的酶,能使50%的蛋白质变为水溶性,消化率可达80%。
还含氨基酸、维生素、植物性脂肪等。
据科学研究表明,纳豆食品不仅调整胃肠功能明显,还具有治疗感冒、痢疾、胀气、胃肠炎、消化不良、残便、便秘等功效,还有防治糖尿病,抑制血栓的生成和溶解血栓的作用,是一种延年益寿、健康的美容食品。
可以说纳豆是一种自然食品,是人类生活智慧的产物。
1987年日本的Sumi博士首次从日本传统食品纳豆中分离出一种具有强烈纤溶作用的碱性蛋白酶并命名纳豆激酶(nattokinase,NK)。
它不但能直接作用交联纤维蛋白,而且还可激活体内的纤溶酶原,从而表现出很强的溶血栓作用。
据报道其制品具有水解淀粉样蛋白,降低血浆纤维蛋白原的第七因子和第八因子,降低血液粘度、降血脂、降胆固醇,降血压,改善血液循环状态,维持血细胞的正常形态和功能,有利于神经损伤的再生,抑制骨质疏松症、抑制动脉粥样硬化等多种功能。
由于NK具有安全性好、成本低、经口服后可迅速入血,作用时间长,胃肠道稳定性好,可由细菌发酵生产、也可由基因工程菌生产等优点,有望被开发为新一代的口服抗血栓药物用于血栓性疾病的预防和治疗。
纳豆激酶发酵培养基的优化
纳豆激酶发酵培养基的优化姓名: 黄江坤班级：制药132学号：201304040225纳豆激酶发酵培养基的优化一、菌种选择选用纳豆枯草杆菌为发酵菌种二、纳豆菌的特性纳豆菌，通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。
生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。
芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。
生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。
孢子耐热性强。
三、纳豆激酶基因的表达NK基因起始密码子为GTG,其上游1b7p处为核糖体结合位点AAAGGAG,SD序列上游为刀T含量高达2%的转录调控区域,1143bp的阅读框架编码29个氨基酸的信号肚,77个氨基酸的前导肽及275个氨基酸的成熟肽。
结构基因的3末端为连续3个终止密码子TAA、TAG、TAA,终止密码子之后一段序列可形成茎环结构,即因子非依赖性终止顺序。
NK的最初产物是381氨基酸的蛋白前体。
其中N端的1一23氨基酸残基是信号肽,24一106氨基酸残基是前导肽。
蛋白前体切除N 端的106个氨基酸残基成为275氨基酸残基的成熟纳豆激酶;而去掉信号肽的产物(含前导肽和成熟肽)称为纳豆激酶酶原。
信号肽包含一个带3个正电荷的亲水氮端以及一段不带电荷的疏水残基序列,其功能是使NK正常分泌出胞外,其切割位点位于Ala一Glu一Aal保守序列之后。
信号肽与成熟肽之间具有的前导肽具有帮助NK正常折叠形成活性构象的功能,目前己发现一些与NK基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。
四、纳豆激酶的蛋白质结构及生化性质：纳豆激酶（NK）是一种丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成的单链多肽结构。
NK肽链无二硫键,活性中心在Asp32,His64和Ser221,与底物结合部位在Serl25,Lenl26和Glyl27处。
NK与大多数枯草杆菌蛋白酶在核苷酸序列上和肽链链氨基酸组成上具有高度同源性,它与B.subtilis1168产生的枯草杆菌蛋白酶E仅有13个核苷酸不同,在肽链组成上仅有2个氨基酸不同,它们成熟肽链一级结构的相同性为99.5%;纳豆激酶等电点为pH8.6,纳豆激酶在pH6.0一12.0范围内稳定,pH低于5.0则不稳定。
纳豆激酶的生产提取工艺
纳豆激酶的生产提取工艺纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，属于胞外酶。
具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。
一、发酵液生产1、菌种活化无菌室内用无菌环挑取保存的纳豆杆菌，连续划线于平板培养基上，盖上培养皿盖，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。
2、种子液的制备种子培养基成分无机离子：MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L其它成分：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L（pH=7.0-7.2）挑取斜面种子接入种子培养基，种龄8 h，装液量50 mL/250 mL，接种量2%，在37 ℃，200 r/min下摇床培养24 h。
3、发酵培养无机离子：MgSO4 2 g/L，Na2HPO4 9 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，CaCl2 0.4 g/L其它成分：麦芽糖15 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，豆油2 g/L（pH=7.0）按照2% (V/V)的接种量转接种子液于发酵培养基中，装液量100 mL/500 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床振荡培养72 h。
二、预处理和固液分离采用离心的方法。
将所得到的发酵液立即分装在的离心管内,冷冻离心10 min,转速5000 r/min。
收集上清液，弃去沉淀，调pH值到7.0，即得粗酶液。
三、提取1、分级盐析法使用分级盐析法，分段将杂蛋白和目的蛋白沉淀，达到分离的目的。
将粗酶液倒于锥形瓶内，利用蛋白质盐析原理,加入研细的固体(NH4)2SO4，使其浓度达到40%，4 ℃过夜，使其析出杂蛋白。
再将过夜的发酵液转移到干净的离心管内，然后离心，弃去沉淀，再次得到上清液，调节上清液pH值到8.6，后转移到锥形瓶内，加入研细的固体（NH4）2SO4，使其浓度达到65%，4 ℃过夜，使目的蛋白沉淀下来。
纳豆激酶分离纯化研究进展
纳豆激酶分离纯化研究进展
黄妍;张勋力;张迎庆
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2017(043)012
【摘要】纳豆激酶是枯草芽孢杆菌发酵过程中产生的一种碱性蛋白酶,具有较强的溶栓作用.与其他溶栓剂相比,纳豆激酶易被吸收,作用迅速,安全性好,可做为新型溶栓剂.文中概述了纳豆激酶的理化性质和作用机制,着重介绍了纳豆激酶的几种常见的分离纯化方法,包括柱层析法、超滤法、萃取法和亲和颗粒法,以及集成化分离纯化技术,并对纳豆激酶分离纯化的新方法进行了展望,以促进纳豆激酶的深入开发和应用.
【总页数】6页(P283-288)
【作者】黄妍;张勋力;张迎庆
【作者单位】湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉,430068;北京纳百恩食品有限公司,北京,102200;湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉,430068【正文语种】中文
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纳豆激酶发酵条件的优化
纳豆激酶发酵条件的优化董超;李楠;程辉彩;张根伟;史延茂【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2009(030)001【摘要】利用Plackett-Burman方法对影响纳豆芽孢杆菌液体发酵的各因素进行评价,筛选出对产纳豆激酶有显著效应的主要因素是豆饼粉浓度.在此基础上, 用响应面分析法对发酵培养基中的豆饼粉浓度、CaCl2浓度、葡萄糖浓度进行优化.所得的最优培养基成分为葡萄糖1%、豆饼粉3%、KH2PO4 0.2%、K2HPO4·3H2O 0.26%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCl2 0.12%.拟合实验结果显示,纳豆激酶液体发酵液的酶活由初始培养条件的约1800U/ml提高到优化后的2226.06U/ml.【总页数】4页(P151-154)【作者】董超;李楠;程辉彩;张根伟;史延茂【作者单位】河北生生物研究所,河北,石家庄,050081;河北生生物研究所,河北,石家庄,050081;河北生生物研究所,河北,石家庄,050081;河北生生物研究所,河北,石家庄,050081;河北生生物研究所,河北,石家庄,050081【正文语种】中文【中图分类】Q946.5【相关文献】1.菜籽粕固态发酵产纳豆激酶条件的优化 [J], 廖杰琼;陈力力;杨伊磊;青文哲;康汝罄2.产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵条件的\r响应面优化 [J], 田莉;卢轶男;朱建;张佑红3.纳豆激酶豆乳液体发酵条件优化 [J], 倪楠; 辛志宏; 许斌; 张丽静; 王艳; 江均平; 王凤忠; 李淑英4.低嘌呤、高纳豆激酶活性枯草芽孢杆菌SH21筛选及发酵条件优化 [J], 庞远祥;谢远红;金君华;刘慧;张红星5.浅析纳豆激酶固体发酵条件优化 [J], 臧学丽;李亚芹;曾凤英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
纳豆激酶液态发酵条件的优化及基因工程菌的制备
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎＬｉｑｕｉｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｏＰｒｏｄｕｃｅＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅａｎｄＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＢａｃｔｅｒｉｕｍｏｆＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｐａｒｔｉａｌｆｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅＢｙＦｅｉｆｅｉＺＨＡＮＧＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＱｉａｎｇＸＩＯＮＧＭａｙ２０１２摘要摘要纳豆（Ｎａｔｔｏ）是大豆经纳豆枯草芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮａｔｔｏ）发酵而成的日本传统食品。
在纳豆的发酵过程中，发现一种具有高溶纤维活性的丝氨酸蛋白酶，须见洋行博士将其命名为纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，ＮＫ）。
纳豆激酶以直接及间接的方式作用于纤维蛋白，从而达到溶栓目的。
另外，纳豆激酶在自然条件下酶活性质比较稳定，安全性高，无毒副作用，半衰期长，分子量小，易被人体吸收，可作口服，作用直接迅速，且药效发挥持续时间长，可由微生物发酵生产，或基因工程技术制备，是一种很有潜力的新型溶血栓药物。
本课题对纳豆激酶的液态发酵条件做了进一步的优化研究，在此基础上，又进行了基因工程制备的研究，为改变纳豆激酶的传统发酵工艺做一定的基础。
首先，研究了摇瓶培养和发酵罐培养时培养基组分和培养条件对纳豆枯草芽孢杆菌产酶的影响。
采用摇瓶液体发酵时，利用单因素实验对碳源、氮源、金属离子、起始ｐＨ、温度、时间、接种量进行研究，运用ｓｔａｎｄａｒｄ．ｄｅｓｉｇｎｓ设计实验获得显著影响因子，以及采用响应面分析实验确定关键因素的最佳水平；之后应用７．５Ｌ发酵罐对搅拌转速、发酵过程的温度、ｐＨ、补料的添加、发酵时间等进行了实验研究。
结果表明：最佳发酵培养基为可溶性淀粉１９ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ：０．２４ｇ／Ｌ、豆粕粉１３．５ｇ／Ｌ、酵母膏１３．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰ０。
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Key words: nattokinase; ultrafiltration; enzyme activity; purification multiple; recovery
纳豆激酶(NK)是纳豆在发酵过程中由纳豆菌产 生的一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白成小肽 和氨基酸，和蚯蚓纤溶酶、蛇毒纤溶酶一样可直 接溶解血栓[1]。研究表明，纳豆激酶是一种溶栓效 果十分显著，并且能够预防和抑制血栓产生与扩
响的差异显著性及各因素水平之间的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 不同操作压力下纳豆激酶料液的膜通量
准确称取处理后的酶液，将超滤压力分别设
定在0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 MPa，试验设置5个
水平(n=5)，超滤温度根据一般蛋白质的超滤数据
设为37 ℃，超滤过程中料液pH 7，测定膜通量及
超滤是以压差为驱动力的膜分离技术。按照 截留分子量的大小，可分离300～1000 ku的大分子 物质。比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较 大的物质则被截留[3]。李立民等[4]通过加入CaCl2和 Na2CO3对发酵液进行盐析处理、离心过滤、超滤浓 缩、离子交换层析等操作之后，得到了较纯的酶， 活力为3528 IU/mg，酶回收率为61.74%。但是，结 果表明，该方法中的盐析处理降低了酶的活力； 另一方面，其利用的超滤只是进行了浓缩，并未 达到分离的目的。由于超滤技术在操作过程中无 相变化，因此不会改变产品的性能和活性，是一 个简单的过程。超滤设备和工艺较其他分离方法 简单，耗能低，滤膜可以反复多次使用；处理量 大，处理时间短，样品残留小，产品收率高[3]。因 此，本研究将液体深层发酵后的纳豆激酶经过滤、 离心处理后，拟直接采用超滤技术对其进行提取， 达到分离纯化的目的。但是超滤膜在使用过程中 的一个主要问题是由于浓差极化、膜孔堵塞及凝 胶层出现等因素的影响，导致膜通量随运行时间 的延长而降低，因此本实验重点研究超滤系统的 操作压力、料液温度、料液pH值对膜通量的影响， 使超滤系统能高效稳定运行，提高产品得率。
增的具有潜在药用价值的物质。 近年来国内外纳豆激酶分离纯化的相关研究
很多，主要有层析法、磁性微球分离法、集成化 分离技术，包括双水相亲和分配技术、扩张床吸 附技术、混合模式扩张床吸附技术等。以上分离
收稿日期： 2009-08-31
* 通讯作者
基金项目： 黑龙江省农垦总局课题(HNKXIV-06-05a)。
·226·
2010 年 第 35 卷 第 5 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
提取物与应用
(6)收集：以0.8 mL/min的速度进行洗脱，分部 收集，每管收集2 mL并对其进行活性及纳豆激酶 含量测定。 1.3.5 纳豆激酶活性的测定 纳豆激酶纤溶活力 的测定采用纤维蛋白平板法，即依照 Astrup[6]等报 道的纤维蛋白平板法，测定方法如下：将琼脂糖、 血纤维蛋白原(Fibrinogen)溶液和凝血酶溶液按一定 比例混合，制成人工血栓平板。取纳豆激酶样品 点样于平板上，37 ℃恒温孵育，测溶解圈直径， 并以尿激酶作标准品对照绘制标准曲线，以测得 纤维蛋白溶解圈面积来表示纳豆激酶的活性。 1.3.6 纳豆激酶含量的测定 纳豆激酶含量的测 定采用考马斯亮蓝法(Braford)[7-8]，方法如下：取一 定量的纳豆激酶样品，用0.15 moL/L NaCl配成100 mL样品溶液。取4支试管，其中一支加入0.15 moL/ L NaCl溶液1 mL(空白对照)，另3支中加入样品1 mL，然后每支试管加入5 mL考马斯亮蓝试剂，立 即混匀，1 h内以1号管为空白对照，在波长595 nm 处比色，并通过标准曲线确定纳豆激酶含量。 1.3.7 数据统计分析方法 通过超滤单因素实验， 确定超滤压力、料液温度、料液pH 对膜通量的影 响，采用SAS8.2软件系统，分析各因素对膜通量影
纳豆激酶含量，实验结果见表1。根据所得数据绘
制出超滤压力与膜通量及纳豆激酶含量的关系曲
线图，见图1。
60
2.5
膜通量/(L/m2·h) NK 含量/(mg/mL)
50 2.0
40 1.5
30
20
1.0 膜通量
0 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 压力/MPa
图 1 不同操作压力对膜通量的影响
1 材料与方法
1.1 材料 纳豆激酶发酵液：由实验室纳豆菌发酵制得；
凝血酶：中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原： 北京奥博星生物技术责任有限公司；尿激酶：中 国药品生物制品检定所；琼脂糖：台湾 MDbio公 司；考马斯亮蓝：sigma公司；其他试剂：分析纯。 1.2 仪器
切向超滤装置：PN 33349，PALL；超滤泵： 7518-00，MASTER FLEX；层析柱：Ф1.6×50 cm， 上海精科实业有限公司；紫外可见分光光度计-T6 新世纪：北京普析通用仪器有限责任公司；台式 离心机：北京京立离心机有限公司；SHB-3循环水 多用真空泵：郑州杜甫仪器厂。 1.3 方法 1.3.1 纳豆激酶粗酶液的制备 将经过深层液体
10
1.0393
B
0.2
46.5
45.0
47.3
46.3 总变异 1161.88 14
J = V/T×A 式中：J 为膜通量，L/m2·h；
V为取样体积，L； T为取样时间，h； A为有效膜面积。 1.3.4 纳豆激酶层析分离 为了得到单一分子量 的纳豆激酶，将超滤分离后的酶液进行进一步的 层析 分离，分别考 察纳豆激酶 在 SephadexG -75、 SephadexG -50 和 HPD -400 中 的 分 离 效 果 ， 通 过 活 性测定及分离效果分析，最终确定采用HPD-400 做为层析分离的填料。 其操作步骤如下： (1)树脂的预处理：称取一定量的树脂，加质 量 分 数 为 2% 的 NaOH 浸 泡 过 夜 ， 用 蒸 馏 水 洗 至 中 性，再加体积分数为95%乙醇浸泡2 h，然后用蒸 馏水洗至乙醇完全除尽，置于50 ℃恒温烘箱中烘 干备用。 (2)装柱：用玻璃棒搅拌均匀后引流灌入内径 1.6 cm的柱子中，让树脂自然沉积，打开出水口， 待树脂自然沉积完毕后，关闭出水口。灌好后的 柱子应表面平整，柱体无气泡，以免影响分离。 (3)平衡：灌好的柱子胶面上用洗脱液加满直 至进样口，并确保没有气泡进入，然后进行2～5柱 床体积平衡。 (4)上样：等洗脱液液面距离胶面2 mm时将样 液延柱壁缓慢加入，防止加样时将胶面冲起影响 分离，上样量1 mL。 (5)洗脱：上样后待样液进入柱床，并与柱床 基本平齐 时 加 入 40% 体 积 浓 度 的 乙 醇 溶 液 进 行 洗 脱。
发酵第2天产生的发酵液以4000 r/min、20 min离心 分离，得到上清液，再将得到的上清液进行抽滤， 可得到滤液。抽滤的目的是防止杂质堵塞滤膜。 1.3.2 纳豆激酶的膜分离方法 将抽滤后得到的 纳豆激酶液通过截留分子量为30000 u的超滤膜， 再将其透过液通过截留分子量为10000 u的超滤膜， 收集中间分子量段的纳豆激酶滤液。分别采用不 同的操作压力、不同料液温度、不同料液pH进行 超滤，考察其对超滤膜膜通量的影响并进行方差 分析，以确定最佳技术参数。 1.3.3 膜通量的测定 超滤系统运行稳定后，按 试验设计控制压力、料液温度、料液pH等操作参 数,，取样，记录一定时间内的透过液，重复3次求 平均值,，按下式计算膜通量。
CHEN Jing-xin, LIU Yan-yan, SHA Wei, ZHANG Li-ping*
(The Food Science of Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy, Daqing 163319)
Abstract: Objective：Studyed the impact of membrane flux on utrafiltration system pressure, ultrafiltration
在表1超滤压力的因素分析中，F值为276.87，
表 1 超滤压力的方差分析及多重比较
压力
y1
y2
y3
平均值 变异来源 SS
df
MS
F值
Pr＞F 5%水平
0.25
52.5
51.1
53.0
52.2 处理间 1151.48
4
287.87 276.98 ＜0.0001 A
0.3
49.5
48.2
50.0
49.2 处理内 10.393
temperature and pH, determined the optimum conditions of nattokinase separation. Methods: the raw materials was prepared from crude nattokinase liquid, by ultrafiltration and chromatography determined the specific activity, purification multiples and recovery rate. Results: The optimized conditions were as following: reaction pressure 0.25 MPa, liquid temperature 37 ℃ , liquid pH 7, the specific activity 9610.46 IU/mg, the purification multiple 2.36 and the recovery rate 92.3% , the purified enzyme was demonstrated by SDS -PAGE to be a homogeneous protein, molecular mass was about 28000 u. Conclusion: It is feasible to separate and purify nattokinase by using ultrafiltration technology,and it can elevate activity and the recovery rate.
纳豆激酶(NK)是纳豆在发酵过程中由纳豆菌产 生的一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白成小肽 和氨基酸，和蚯蚓纤溶酶、蛇毒纤溶酶一样可直 接溶解血栓[1]。研究表明，纳豆激酶是一种溶栓效 果十分显著，并且能够预防和抑制血栓产生与扩
响的差异显著性及各因素水平之间的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 不同操作压力下纳豆激酶料液的膜通量
准确称取处理后的酶液，将超滤压力分别设
定在0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 MPa，试验设置5个
水平(n=5)，超滤温度根据一般蛋白质的超滤数据
设为37 ℃，超滤过程中料液pH 7，测定膜通量及
超滤是以压差为驱动力的膜分离技术。按照 截留分子量的大小，可分离300～1000 ku的大分子 物质。比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较 大的物质则被截留[3]。李立民等[4]通过加入CaCl2和 Na2CO3对发酵液进行盐析处理、离心过滤、超滤浓 缩、离子交换层析等操作之后，得到了较纯的酶， 活力为3528 IU/mg，酶回收率为61.74%。但是，结 果表明，该方法中的盐析处理降低了酶的活力； 另一方面，其利用的超滤只是进行了浓缩，并未 达到分离的目的。由于超滤技术在操作过程中无 相变化，因此不会改变产品的性能和活性，是一 个简单的过程。超滤设备和工艺较其他分离方法 简单，耗能低，滤膜可以反复多次使用；处理量 大，处理时间短，样品残留小，产品收率高[3]。因 此，本研究将液体深层发酵后的纳豆激酶经过滤、 离心处理后，拟直接采用超滤技术对其进行提取， 达到分离纯化的目的。但是超滤膜在使用过程中 的一个主要问题是由于浓差极化、膜孔堵塞及凝 胶层出现等因素的影响，导致膜通量随运行时间 的延长而降低，因此本实验重点研究超滤系统的 操作压力、料液温度、料液pH值对膜通量的影响， 使超滤系统能高效稳定运行，提高产品得率。
增的具有潜在药用价值的物质。 近年来国内外纳豆激酶分离纯化的相关研究
很多，主要有层析法、磁性微球分离法、集成化 分离技术，包括双水相亲和分配技术、扩张床吸 附技术、混合模式扩张床吸附技术等。以上分离
收稿日期： 2009-08-31
* 通讯作者
基金项目： 黑龙江省农垦总局课题(HNKXIV-06-05a)。
·226·
2010 年 第 35 卷 第 5 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
提取物与应用
(6)收集：以0.8 mL/min的速度进行洗脱，分部 收集，每管收集2 mL并对其进行活性及纳豆激酶 含量测定。 1.3.5 纳豆激酶活性的测定 纳豆激酶纤溶活力 的测定采用纤维蛋白平板法，即依照 Astrup[6]等报 道的纤维蛋白平板法，测定方法如下：将琼脂糖、 血纤维蛋白原(Fibrinogen)溶液和凝血酶溶液按一定 比例混合，制成人工血栓平板。取纳豆激酶样品 点样于平板上，37 ℃恒温孵育，测溶解圈直径， 并以尿激酶作标准品对照绘制标准曲线，以测得 纤维蛋白溶解圈面积来表示纳豆激酶的活性。 1.3.6 纳豆激酶含量的测定 纳豆激酶含量的测 定采用考马斯亮蓝法(Braford)[7-8]，方法如下：取一 定量的纳豆激酶样品，用0.15 moL/L NaCl配成100 mL样品溶液。取4支试管，其中一支加入0.15 moL/ L NaCl溶液1 mL(空白对照)，另3支中加入样品1 mL，然后每支试管加入5 mL考马斯亮蓝试剂，立 即混匀，1 h内以1号管为空白对照，在波长595 nm 处比色，并通过标准曲线确定纳豆激酶含量。 1.3.7 数据统计分析方法 通过超滤单因素实验， 确定超滤压力、料液温度、料液pH 对膜通量的影 响，采用SAS8.2软件系统，分析各因素对膜通量影
纳豆激酶含量，实验结果见表1。根据所得数据绘
制出超滤压力与膜通量及纳豆激酶含量的关系曲
线图，见图1。
60
2.5
膜通量/(L/m2·h) NK 含量/(mg/mL)
50 2.0
40 1.5
30
20
1.0 膜通量
0 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 压力/MPa
图 1 不同操作压力对膜通量的影响
1 材料与方法
1.1 材料 纳豆激酶发酵液：由实验室纳豆菌发酵制得；
凝血酶：中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原： 北京奥博星生物技术责任有限公司；尿激酶：中 国药品生物制品检定所；琼脂糖：台湾 MDbio公 司；考马斯亮蓝：sigma公司；其他试剂：分析纯。 1.2 仪器
切向超滤装置：PN 33349，PALL；超滤泵： 7518-00，MASTER FLEX；层析柱：Ф1.6×50 cm， 上海精科实业有限公司；紫外可见分光光度计-T6 新世纪：北京普析通用仪器有限责任公司；台式 离心机：北京京立离心机有限公司；SHB-3循环水 多用真空泵：郑州杜甫仪器厂。 1.3 方法 1.3.1 纳豆激酶粗酶液的制备 将经过深层液体
10
1.0393
B
0.2
46.5
45.0
47.3
46.3 总变异 1161.88 14
J = V/T×A 式中：J 为膜通量，L/m2·h；
V为取样体积，L； T为取样时间，h； A为有效膜面积。 1.3.4 纳豆激酶层析分离 为了得到单一分子量 的纳豆激酶，将超滤分离后的酶液进行进一步的 层析 分离，分别考 察纳豆激酶 在 SephadexG -75、 SephadexG -50 和 HPD -400 中 的 分 离 效 果 ， 通 过 活 性测定及分离效果分析，最终确定采用HPD-400 做为层析分离的填料。 其操作步骤如下： (1)树脂的预处理：称取一定量的树脂，加质 量 分 数 为 2% 的 NaOH 浸 泡 过 夜 ， 用 蒸 馏 水 洗 至 中 性，再加体积分数为95%乙醇浸泡2 h，然后用蒸 馏水洗至乙醇完全除尽，置于50 ℃恒温烘箱中烘 干备用。 (2)装柱：用玻璃棒搅拌均匀后引流灌入内径 1.6 cm的柱子中，让树脂自然沉积，打开出水口， 待树脂自然沉积完毕后，关闭出水口。灌好后的 柱子应表面平整，柱体无气泡，以免影响分离。 (3)平衡：灌好的柱子胶面上用洗脱液加满直 至进样口，并确保没有气泡进入，然后进行2～5柱 床体积平衡。 (4)上样：等洗脱液液面距离胶面2 mm时将样 液延柱壁缓慢加入，防止加样时将胶面冲起影响 分离，上样量1 mL。 (5)洗脱：上样后待样液进入柱床，并与柱床 基本平齐 时 加 入 40% 体 积 浓 度 的 乙 醇 溶 液 进 行 洗 脱。
发酵第2天产生的发酵液以4000 r/min、20 min离心 分离，得到上清液，再将得到的上清液进行抽滤， 可得到滤液。抽滤的目的是防止杂质堵塞滤膜。 1.3.2 纳豆激酶的膜分离方法 将抽滤后得到的 纳豆激酶液通过截留分子量为30000 u的超滤膜， 再将其透过液通过截留分子量为10000 u的超滤膜， 收集中间分子量段的纳豆激酶滤液。分别采用不 同的操作压力、不同料液温度、不同料液pH进行 超滤，考察其对超滤膜膜通量的影响并进行方差 分析，以确定最佳技术参数。 1.3.3 膜通量的测定 超滤系统运行稳定后，按 试验设计控制压力、料液温度、料液pH等操作参 数,，取样，记录一定时间内的透过液，重复3次求 平均值,，按下式计算膜通量。
CHEN Jing-xin, LIU Yan-yan, SHA Wei, ZHANG Li-ping*
(The Food Science of Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy, Daqing 163319)
Abstract: Objective：Studyed the impact of membrane flux on utrafiltration system pressure, ultrafiltration
在表1超滤压力的因素分析中，F值为276.87，
表 1 超滤压力的方差分析及多重比较
压力
y1
y2
y3
平均值 变异来源 SS
df
MS
F值
Pr＞F 5%水平
0.25
52.5
51.1
53.0
52.2 处理间 1151.48
4
287.87 276.98 ＜0.0001 A
0.3
49.5
48.2
50.0
49.2 处理内 10.393
temperature and pH, determined the optimum conditions of nattokinase separation. Methods: the raw materials was prepared from crude nattokinase liquid, by ultrafiltration and chromatography determined the specific activity, purification multiples and recovery rate. Results: The optimized conditions were as following: reaction pressure 0.25 MPa, liquid temperature 37 ℃ , liquid pH 7, the specific activity 9610.46 IU/mg, the purification multiple 2.36 and the recovery rate 92.3% , the purified enzyme was demonstrated by SDS -PAGE to be a homogeneous protein, molecular mass was about 28000 u. Conclusion: It is feasible to separate and purify nattokinase by using ultrafiltration technology,and it can elevate activity and the recovery rate.