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第九节疏水作用色谱疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。
此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。
目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理(一) 疏水作用疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。
而根据热力学公式△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。
当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。
蛋白质疏水性测定方法的相关性及适用性曾茂茂，王 霄，陈 洁*(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)摘 要：针对蛋白质的疏水性，以食品中常用的蛋白质如大豆分离蛋白(SPI) 及其水解物和乳清蛋白为对象，研究不同疏水性测定方法的相关性及适用性。
结果表明：ANS 荧光探针法对各种蛋白质及其水解物(DH ＜23)疏水性的测定均比较合适；CPA 荧光探针法不适合于测定疏水性较弱的蛋白质；反相高效液相色谱法较适合测定疏水性适中及较强的蛋白质；表面张力法中如采用气液界面参数进行表征，则其线性存在一定的缺陷。
关键词：蛋白质；疏水性；荧光探针法；高效液相色谱(HPLC)；表面张力Correlation and Applicability of Different Methods for Determining Protein HydrophobicityZENG Mao-mao ，WANG Xiao ，CHEN Jie*(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)Abstract ：Proteins regularly used in foods such as soy protein isolate (SPI) and whey protein as well as their hydrolysates were selected as the experimental subjects to explore the correlation and applicability of different methods for determining protein hydrophobicity. The results indicated that ANS (1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid) fluorescent probe method was an appropriate method for measuring the hydrophobicity of various kinds of proteins and their hydrolysates (DH < 23); CPA (cis -parinaric) fluorescent probe method was not suitable for determining proteins with relatively weak hydrophobicity; reverse-phase high performance liquid chromatography method was a good method for proteins with relatively moderate and strong hydrophobicity; the linearity of surface tension method had shortcomings when the hydrophobicity was characterized by gas-liquid interface parameters. All of these investigations provided a theoretical basis for determining hydrophobicity in food protein systems.Key words ：protein ；hydrophobicity ；fluorescent probe method ；high performance liquid chromatography (HPLC)；surface tension中图分类号：TQ93 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)15-0117-04收稿日期：2010-11-12基金项目：国家自然科学基金项目(20976071；30972290)作者简介：曾茂茂(1982—)，男，讲师，博士，研究方向为食品蛋白质功能。
蛋白质的疏水色谱法一、样品准备在进行疏水色谱法之前，需要先准备好蛋白质样品。
通常采用细胞或组织提取的方法来获取蛋白质样品。
首先，将细胞或组织放入匀浆器中，加入适量的缓冲液，然后进行研磨和匀浆。
接着，将匀浆液进行离心处理，分离出上清液和沉淀。
最后，通过滤膜过滤上清液，收集滤液并测定蛋白质浓度。
二、柱平衡在进行疏水色谱之前，需要对色谱柱进行平衡。
这是因为色谱柱中的固定相具有吸附作用，如果不进行平衡，会影响后续的分离效果。
通常采用缓冲液作为平衡液，将色谱柱装入平衡液中，进行充分的平衡，直到色谱柱的流出液中不再含有杂质峰。
三、疏水作用疏水作用是蛋白质在疏水色谱法中的主要分离原理。
蛋白质分子具有疏水性和亲水性两种特征。
疏水性蛋白质在遇到非极性固定相时，会被吸附并滞留在固定相中，而亲水性蛋白质则会被流动相带着流出色谱柱。
通过调整流动相的组成和条件，可以控制蛋白质的疏水作用力，从而实现蛋白质的有效分离。
四、洗脱洗脱是疏水色谱法中的重要步骤。
通常采用改变流动相的pH值、离子强度或添加有机溶剂等方法来降低蛋白质分子与固定相之间的相互作用力，使蛋白质分子被洗脱下来。
根据不同的实验需求，可以选择不同的洗脱方式和洗脱液。
五、检测在疏水色谱法中，需要对蛋白质样品进行检测。
常用的检测方法包括紫外检测、示差扫描和质谱检测等。
这些方法可以测定蛋白质的分子量、等电点等基本信息，并对其纯度进行评估。
根据实验需求选择合适的检测方法。
六、数据处理在完成疏水色谱实验后，需要对实验数据进行处理和分析。
通常采用表格或图示的形式来表示实验结果。
表格中可以列出各个时间点的洗脱液体积、洗脱峰的面积和蛋白质浓度等信息。
图示则可以直观地展示蛋白质分子的分离效果和纯度等数据。
通过对数据的处理和分析，可以评估疏水色谱法的分离效果和蛋白质样品的纯度。
七、清洗和维护在进行疏水色谱实验过程中，需要注意对色谱柱的清洗和维护。
在每次实验结束后，需要将色谱柱彻底清洗干净，避免残留物对下一次实验造成干扰。
第九节疏水作用色谱疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。
此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC 已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。
目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理(一) 疏水作用疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。
而根据热力学公式△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。
当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。
对蛋白质分离纯化的方法
蛋白质分离纯化的方法有很多种，常用的方法如下：
1. 溶液的分离：利用差速离心、过滤或超滤等方法，将悬浮液或溶液中的蛋白质与其他组分分离开。
2. 色谱层析：将蛋白质溶液经过色谱柱，利用分子大小、电荷、亲疏水性等物理性质作用于柱内填充物，实现蛋白质的分离纯化。
3. 电泳：利用蛋白质在电场中的电荷性质以及大小和形状的差异，在凝胶电泳或毛细管电泳中进行分离纯化。
4. 凝胶过滤：利用凝胶的孔隙结构，根据蛋白质的分子大小将蛋白质分离开。
5. 亲和层析：利用蛋白质与亲和配体之间的特异性相互作用实现分离纯化。
6. 离子交换层析：利用蛋白质与离子交换树脂之间的电荷相互作用实现分离纯化。
7. 逆流电泳：利用蛋白质在电场中的电荷性质和溶液中的流动，通过逆流电泳系统实现蛋白质的分离纯化。
8. 蛋白质沉淀：利用加入盐、酸、有机溶剂等物质改变蛋白质的溶解度，使其沉淀下来。
以上是常用的蛋白质分离纯化方法，不同方法适用于不同的蛋白质特性和实验目的。
需要根据具体情况选择合适的方法进行操作。
疏水色谱的原理和应用概述疏水色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是一种常用的分离技术，基于样品中疏水性物质与固定相之间的相互作用而实现分离。
疏水色谱广泛应用于生物分子的纯化和分析中，特别适用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子。
原理疏水色谱的原理基于疏水作用，即非极性物质在水溶液中倾向于聚集在一起。
固定相通常是由疏水性材料制成，如疏水性基团修饰的凝胶或疏水性的磁性微球等。
样品在进样时会与固定相中的疏水性基团发生相互作用，疏水性物质在固定相上停留时间较长，而亲水性物质则快速通过。
分离机理疏水色谱的分离机理主要是基于溶剂极性对样品和固定相之间相互作用的影响。
当样品在经过固定相时，疏水性物质会与固定相上的疏水性基团产生静电相互作用和范德华相互作用等力。
疏水性物质与固定相的相互作用力较强，因此在固定相上停留的时间较长。
而亲水性物质由于与水分子中的氢键形成更稳定的结构，因此在固定相上的停留时间较短。
应用生物分子纯化疏水色谱在生物分子纯化中起到关键的作用。
通过调整溶剂体系中的离子强度和pH值等条件，可以有效地实现生物分子的分离和纯化。
疏水色谱常用于从复杂的混合物中纯化特定的蛋白质、酶和抗体等生物分子。
蛋白质结构分析疏水色谱也可用于蛋白质的结构分析。
通过在不同的溶剂条件下进行疏水色谱分离，可以得到蛋白质在不同溶剂条件下的保留时间信息，从而揭示蛋白质的疏水性特征，进一步了解蛋白质的结构和功能。
药物分析疏水色谱在药物分析中也有广泛的应用。
许多药物分析方法采用疏水色谱技术进行样品的分离和纯化。
疏水色谱对药物分析的应用领域包括药物开发、药物代谢和药物残留等。
氨基酸和肽段分析疏水色谱可以用于氨基酸和肽段的分析。
氨基酸和肽段具有疏水性的特点，因此可以通过疏水色谱进行分离。
疏水色谱在氨基酸和肽段的定量分析和序列分析中有很高的选择性和敏感性。
核酸分离和纯化疏水色谱也可以应用于核酸的分离和纯化。
疏水色谱的
疏水色谱的概念：利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同，用流动相洗脱时，各组分迁移速度不同而达到分离的目的。
疏水色谱的原理：疏水作用色谱是利用样品中各组分具有不同的疏水作用的性质进行分离，主要分离对象是蛋白质。
疏水作用色谱固定相的非极性比较弱，流动相多采用高浓度盐缓冲液进行梯度洗脱。
温和的分离条件，可以避免反相色谱中由于固定相较强的疏水性和有机流动相引起蛋白质的不可逆吸附和变性，因此特别适用于活性物质的分离与纯化。
疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。
蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。
当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。
利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作
用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。
蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。
在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。
高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。
这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。
由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的
组成使蛋白质得到分离。
