疏水色谱分离蛋白质

第九节疏水作用色谱疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。

关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。

此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。

由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。

目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。

一、疏水作用色谱基本原理(一) 疏水作用疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。

根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。

而根据热力学公式△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。

当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。

蛋白质疏水性测定方法的相关性及适用性曾茂茂，王 霄，陈 洁*(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)摘 要：针对蛋白质的疏水性，以食品中常用的蛋白质如大豆分离蛋白(SPI) 及其水解物和乳清蛋白为对象，研究不同疏水性测定方法的相关性及适用性。

结果表明：ANS 荧光探针法对各种蛋白质及其水解物(DH ＜23)疏水性的测定均比较合适；CPA 荧光探针法不适合于测定疏水性较弱的蛋白质；反相高效液相色谱法较适合测定疏水性适中及较强的蛋白质；表面张力法中如采用气液界面参数进行表征，则其线性存在一定的缺陷。

关键词：蛋白质；疏水性；荧光探针法；高效液相色谱(HPLC)；表面张力Correlation and Applicability of Different Methods for Determining Protein HydrophobicityZENG Mao-mao ，WANG Xiao ，CHEN Jie*(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)Abstract ：Proteins regularly used in foods such as soy protein isolate (SPI) and whey protein as well as their hydrolysates were selected as the experimental subjects to explore the correlation and applicability of different methods for determining protein hydrophobicity. The results indicated that ANS (1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid) fluorescent probe method was an appropriate method for measuring the hydrophobicity of various kinds of proteins and their hydrolysates (DH < 23); CPA (cis -parinaric) fluorescent probe method was not suitable for determining proteins with relatively weak hydrophobicity; reverse-phase high performance liquid chromatography method was a good method for proteins with relatively moderate and strong hydrophobicity; the linearity of surface tension method had shortcomings when the hydrophobicity was characterized by gas-liquid interface parameters. All of these investigations provided a theoretical basis for determining hydrophobicity in food protein systems.Key words ：protein ；hydrophobicity ；fluorescent probe method ；high performance liquid chromatography (HPLC)；surface tension中图分类号：TQ93 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)15-0117-04收稿日期：2010-11-12基金项目：国家自然科学基金项目(20976071；30972290)作者简介：曾茂茂(1982—)，男，讲师，博士，研究方向为食品蛋白质功能。

蛋白质的疏水色谱法一、样品准备在进行疏水色谱法之前，需要先准备好蛋白质样品。

通常采用细胞或组织提取的方法来获取蛋白质样品。

首先，将细胞或组织放入匀浆器中，加入适量的缓冲液，然后进行研磨和匀浆。

接着，将匀浆液进行离心处理，分离出上清液和沉淀。

最后，通过滤膜过滤上清液，收集滤液并测定蛋白质浓度。

二、柱平衡在进行疏水色谱之前，需要对色谱柱进行平衡。

这是因为色谱柱中的固定相具有吸附作用，如果不进行平衡，会影响后续的分离效果。

通常采用缓冲液作为平衡液，将色谱柱装入平衡液中，进行充分的平衡，直到色谱柱的流出液中不再含有杂质峰。

三、疏水作用疏水作用是蛋白质在疏水色谱法中的主要分离原理。

蛋白质分子具有疏水性和亲水性两种特征。

疏水性蛋白质在遇到非极性固定相时，会被吸附并滞留在固定相中，而亲水性蛋白质则会被流动相带着流出色谱柱。

通过调整流动相的组成和条件，可以控制蛋白质的疏水作用力，从而实现蛋白质的有效分离。

四、洗脱洗脱是疏水色谱法中的重要步骤。

通常采用改变流动相的pH值、离子强度或添加有机溶剂等方法来降低蛋白质分子与固定相之间的相互作用力，使蛋白质分子被洗脱下来。

根据不同的实验需求，可以选择不同的洗脱方式和洗脱液。

五、检测在疏水色谱法中，需要对蛋白质样品进行检测。

常用的检测方法包括紫外检测、示差扫描和质谱检测等。

这些方法可以测定蛋白质的分子量、等电点等基本信息，并对其纯度进行评估。

根据实验需求选择合适的检测方法。

六、数据处理在完成疏水色谱实验后，需要对实验数据进行处理和分析。

通常采用表格或图示的形式来表示实验结果。

表格中可以列出各个时间点的洗脱液体积、洗脱峰的面积和蛋白质浓度等信息。

图示则可以直观地展示蛋白质分子的分离效果和纯度等数据。

通过对数据的处理和分析，可以评估疏水色谱法的分离效果和蛋白质样品的纯度。

七、清洗和维护在进行疏水色谱实验过程中，需要注意对色谱柱的清洗和维护。

在每次实验结束后，需要将色谱柱彻底清洗干净，避免残留物对下一次实验造成干扰。

第九节疏水作用色谱疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。

关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。

此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC 已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。

由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。

目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。

一、疏水作用色谱基本原理(一) 疏水作用疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。

根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。

而根据热力学公式△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。

当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。

对蛋白质分离纯化的方法
蛋白质分离纯化的方法有很多种，常用的方法如下：
1. 溶液的分离：利用差速离心、过滤或超滤等方法，将悬浮液或溶液中的蛋白质与其他组分分离开。

2. 色谱层析：将蛋白质溶液经过色谱柱，利用分子大小、电荷、亲疏水性等物理性质作用于柱内填充物，实现蛋白质的分离纯化。

3. 电泳：利用蛋白质在电场中的电荷性质以及大小和形状的差异，在凝胶电泳或毛细管电泳中进行分离纯化。

4. 凝胶过滤：利用凝胶的孔隙结构，根据蛋白质的分子大小将蛋白质分离开。

5. 亲和层析：利用蛋白质与亲和配体之间的特异性相互作用实现分离纯化。

6. 离子交换层析：利用蛋白质与离子交换树脂之间的电荷相互作用实现分离纯化。

7. 逆流电泳：利用蛋白质在电场中的电荷性质和溶液中的流动，通过逆流电泳系统实现蛋白质的分离纯化。

8. 蛋白质沉淀：利用加入盐、酸、有机溶剂等物质改变蛋白质的溶解度，使其沉淀下来。

以上是常用的蛋白质分离纯化方法，不同方法适用于不同的蛋白质特性和实验目的。

需要根据具体情况选择合适的方法进行操作。

疏水色谱的原理和应用概述疏水色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是一种常用的分离技术，基于样品中疏水性物质与固定相之间的相互作用而实现分离。

疏水色谱广泛应用于生物分子的纯化和分析中，特别适用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子。

原理疏水色谱的原理基于疏水作用，即非极性物质在水溶液中倾向于聚集在一起。

固定相通常是由疏水性材料制成，如疏水性基团修饰的凝胶或疏水性的磁性微球等。

样品在进样时会与固定相中的疏水性基团发生相互作用，疏水性物质在固定相上停留时间较长，而亲水性物质则快速通过。

分离机理疏水色谱的分离机理主要是基于溶剂极性对样品和固定相之间相互作用的影响。

当样品在经过固定相时，疏水性物质会与固定相上的疏水性基团产生静电相互作用和范德华相互作用等力。

疏水性物质与固定相的相互作用力较强，因此在固定相上停留的时间较长。

而亲水性物质由于与水分子中的氢键形成更稳定的结构，因此在固定相上的停留时间较短。

应用生物分子纯化疏水色谱在生物分子纯化中起到关键的作用。

通过调整溶剂体系中的离子强度和pH值等条件，可以有效地实现生物分子的分离和纯化。

疏水色谱常用于从复杂的混合物中纯化特定的蛋白质、酶和抗体等生物分子。

蛋白质结构分析疏水色谱也可用于蛋白质的结构分析。

通过在不同的溶剂条件下进行疏水色谱分离，可以得到蛋白质在不同溶剂条件下的保留时间信息，从而揭示蛋白质的疏水性特征，进一步了解蛋白质的结构和功能。

药物分析疏水色谱在药物分析中也有广泛的应用。

许多药物分析方法采用疏水色谱技术进行样品的分离和纯化。

疏水色谱对药物分析的应用领域包括药物开发、药物代谢和药物残留等。

氨基酸和肽段分析疏水色谱可以用于氨基酸和肽段的分析。

氨基酸和肽段具有疏水性的特点，因此可以通过疏水色谱进行分离。

疏水色谱在氨基酸和肽段的定量分析和序列分析中有很高的选择性和敏感性。

核酸分离和纯化疏水色谱也可以应用于核酸的分离和纯化。

疏水色谱的
疏水色谱的概念：利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同，用流动相洗脱时，各组分迁移速度不同而达到分离的目的。

疏水色谱的原理：疏水作用色谱是利用样品中各组分具有不同的疏水作用的性质进行分离，主要分离对象是蛋白质。

疏水作用色谱固定相的非极性比较弱，流动相多采用高浓度盐缓冲液进行梯度洗脱。

温和的分离条件，可以避免反相色谱中由于固定相较强的疏水性和有机流动相引起蛋白质的不可逆吸附和变性，因此特别适用于活性物质的分离与纯化。

疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。

蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。

当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。

利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作
用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。

蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。

在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。

高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。

这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。

由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的
组成使蛋白质得到分离。

疏水层析色谱的原理及应用1. 简介疏水层析色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，简称 HIC）是一种常用的色谱技术，利用样品中溶质与柱上固定相之间的疏水作用来分离和纯化目标蛋白质。

本文将介绍疏水层析色谱的原理和应用。

2. 原理疏水层析色谱的原理基于疏水作用。

在疏水层析柱上，通常使用亲疏水性互补的固定相材料。

样品中的溶质通过与固定相发生疏水作用，从而被留下来。

疏水层析柱的选择参数主要包括固定相的亲水/疏水程度、样品溶液的 pH 值以及溶液中的盐浓度。

3. 疏水层析色谱的应用3.1 蛋白质分离与纯化疏水层析色谱广泛应用于蛋白质的分离与纯化。

根据蛋白质的疏水性质，可以通过调节溶液 pH 值和盐浓度来改变蛋白质与固定相之间的疏水相互作用，实现蛋白质的选择性吸附和洗脱。

3.2 病毒和肽的富集疏水层析色谱也可以用于病毒和肽的富集。

一些疏水层析柱可以选择性地吸附病毒和肽，并去除其他的杂质物质。

这样可以提高样品中目标物的浓度，方便后续的分析和研究。

3.3 降低样品的复杂性对于复杂样品，疏水层析色谱可以通过去除一部分干扰物质，降低样品的复杂性。

通过人为调节固定相的亲疏水性质，可以实现不同溶质的选择性吸附，并采用洗脱方法将目标物质洗脱出来。

3.4 聚合物分离疏水层析色谱还可以应用于聚合物的分离。

通过调节溶液 pH 值和盐浓度，可以改变聚合物与固定相之间的疏水作用，实现聚合物之间的分离和纯化。

3.5 生物药物制剂的纯化疏水层析色谱在生物药物制剂的纯化中发挥重要作用。

对于重组蛋白质等生物药物，疏水层析色谱可以有效地去除杂质蛋白质和其他有机物，提高药物纯度。

4. 优势和限制4.1 优势•疏水层析色谱对样品中溶质的选择性吸附具有一定的调节性，适用于多种样品分离与纯化；•疏水层析色谱操作简单、设备要求低，易于应用于实验室和工业生产中。

4.2 限制•疏水层析柱通常需要根据样品性质进行特定的预处理和优化；•高盐浓度的使用可能导致样品与固定相缓慢结合，降低目标物质的得率。

色谱法在蛋白质分离纯化中的应用
色谱法在蛋白质分离和纯化中广泛应用，其中一些常见的色谱方法包括：
1. 亲和色谱（Affinity Chromatography）：利用特定的亲和剂与目标蛋白质之间的特异结合，实现对目标蛋白质的富集和纯化。

亲和色谱常用于从复杂混合物中纯化特定的蛋白质，例如使用亲和树脂上的抗体结合目标蛋白质。

2. 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography）：基于蛋白质与离子交换树脂之间的电荷相互作用进行分离。

离子交换色谱可根据蛋白质的电荷性质选择合适的离子交换树脂，实现对蛋白质的选择性吸附和洗脱。

3. 凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography）：基于蛋白质的大小进行分离。

在凝胶过滤色谱中，蛋白质溶液通过具有特定孔径的凝胶柱，较大的蛋白质无法进入凝胶内部，较小的蛋白质则会在凝胶内部扩散，从而实现分离。

4. 逆向相色谱（Reverse Phase Chromatography）：逆向相色谱是基于蛋白质与疏水性固定相之间的亲疏水作用进行分离。

通过调节溶剂系统的极性和流动相的成分，可以控制蛋白质在逆向相色谱柱中的保留时间，实现对蛋白质的分离。

这些色谱方法可以单独应用或者结合使用，根据蛋白质的特性和目标纯化的要求选择合适的色谱方法，以获得高纯度的目标蛋白质。

蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质是生物体内重要的功能分子，它们在细胞的结构和功能中扮演着重要角色。

蛋白质的纯化和分离是研究蛋白质结构和功能的基础。

本文将介绍蛋白质分离纯化的一般原则和方法。

蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。

蛋白质具有不同的分子量、电荷、溶解性、亲疏水性等特性，可以通过这些特性来实现蛋白质的分离纯化。

蛋白质分离纯化的第一步是提取蛋白质。

提取蛋白质的方法有多种，常见的包括机械破碎、超声波破碎、溶剂提取等。

提取蛋白质的目的是将其从细胞或组织中释放出来，为后续的分离纯化步骤做准备。

蛋白质的分离纯化可以通过多种方法来实现。

其中最常用的方法是色谱技术。

色谱技术基于蛋白质的物理化学性质，将混合溶液中的蛋白质分离开来。

常见的色谱技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱、逆相色谱等。

凝胶过滤色谱是一种基于蛋白质分子量的分离方法。

其原理是通过孔径大小选择性地分离不同分子量的蛋白质。

凝胶过滤色谱常用于蛋白质的初步分离和浓缩。

离子交换色谱是一种基于蛋白质电荷的分离方法。

其原理是通过蛋白质与离子交换基质之间的相互作用来实现分离。

离子交换色谱可以根据蛋白质的电荷性质选择性地分离不同电荷的蛋白质。

亲和色谱是一种基于蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用来实现分离的方法。

亲和色谱可以利用蛋白质与亲和基质之间的特异性结合，选择性地分离目标蛋白质。

逆相色谱是一种基于蛋白质亲疏水性的分离方法。

其原理是利用蛋白质与逆相基质之间的亲疏水作用来实现分离。

逆相色谱可以根据蛋白质的亲疏水性选择性地分离不同性质的蛋白质。

还有一些其他的蛋白质分离纯化方法，如电泳、超高速离心、超滤等。

这些方法在特定的实验条件下可以实现蛋白质的分离纯化。

蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。

通过选择合适的分离纯化方法，可以有效地分离出目标蛋白质，并去除其他杂质。

蛋白质的纯化程度越高，其质量和活性也就越好，对于后续的研究和应用具有重要意义。

蛋白质色谱分离技术
蛋白质色谱分离技术是一种常用的蛋白质分离纯化技术，主要依据蛋白质的特定位点的差异进行分离。

该技术主要包括以下几种：
1. 凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography，GFC）：也称为尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）。

这种技术根据分子的流体动力学体积或大小差异来进行分离，适用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质。

同时，这种技术也可以用于测定蛋白质的分子量。

通过单一凝胶床可以将分子大小相差25％的样品完全分开。

此外，凝胶过滤色谱还可以用于样品的浓缩和脱盐去热源和脱色等。

2. 亲和色谱：这是蛋白质检测中最专一的分离技术，可以从复杂的混合物中直接分离出目标蛋白质分子。

3. 疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）：这种技术利用样品中各组份与色谱填料上配基相互作用力的差异，在洗脱时由于各组份移动速度的不同而达到分离的目的。

其分离机制类似于反相液相色谱，只是用水性缓冲液代替了有机溶剂。

每种蛋白质色谱分离技术都有其独特的应用和限制，因此在选择和应用时需要根据具体情况进行考虑。

蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。

本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。

关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。

对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。

蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。

本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。

1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。

2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。

例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。

有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。

3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。

4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。

1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。

蛋白质色谱分离方法摘要蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。

所以分离和检测蛋白质一直是人们研究的热点。

依据蛋白质的物理、化学及生物学特性，已有多种分离手段，如：超滤法、SDS-PAGE、亲和层析等，其中，液相色谱分离技术由于具有重复性好、分辨率高等优势在蛋白质分离检测中得到了广泛的应用。

关键词高效液相色谱高效离子交换色谱反相高效液相色谱高效凝胶过滤色谱高效亲和色谱一、引言蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。

蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质完全的从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

1、蛋白质纯化的总战略考虑蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、细菌破碎液或组织匀浆中提取出来，收率至少达到90%以上。

然后进一步作精纯化，这第一步要求去掉大部分杂蛋白，同时要使样品的体积得到充分浓缩，一般要求要浓缩几十到几百倍，粗提液的体积大大缩小，便于下一步精纯化。

而且每一步都要做电泳判断纯化效果。

2、蛋白质分离纯化技术的选择要尽可能多地了解目标蛋白的结构、氨基酸组成、氨基酸序列，以及蛋白质的空间结构所决定的物理、化学、生物化学和物理化学性质等信息，根据不同蛋白质之间的性质差异或者改变条件使之具有差异，利用一种或多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择最佳的蛋白质提纯方法。

二、色谱技术简介1、色谱分离技术基本概念色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。

它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。

当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。

第九节疏水作用色谱疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。

关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。

此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。

由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。

目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。

一、疏水作用色谱基本原理(一) 疏水作用疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。

根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。

而根据热力学公式△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。

当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。