洋葱鳞茎细胞骨架及包间连丝的观察

实验五
植物细胞骨架和胞间连 丝的观察
一、植物细胞骨架的光学显微镜观察 （一）实验目的 掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光 学显微镜下细胞骨架的网状结构。 （二）实验原理 细胞骨架定义： 狭义的细胞骨架（cytoskeleton）概念是指真核细胞中的蛋 白纤维网络结构。它所组成的结构体系称为 “细胞骨架系 统”，与细胞内的遗传系统、生物膜系统、并称 “细胞内的 三大系统”。包含三类蛋白纤丝？？
植物细胞用适当浓度的 TritonX—100 处理 后， 可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白 质却保存完好。 考马斯亮蓝 R250 (Coomassie brilliant blue R250) 是一种蛋白质染料，处理后的材料用考 马斯亮蓝 R250 染色后，用光学显微镜观察， 可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。
（二）实验材料、用品 1、材料：新鲜的红辣椒果实
2、仪器：显微镜，载玻片，镊子，玻璃吸 管，刀片，碘液，红墨水等。
（三）实验步骤
剪取一小块红辣椒，用刀片小心刮去果肉，留下一 层极薄露白的表皮，分别进行以下操作： 1. 放在载玻片上，滴一滴水，盖上盖玻片后即可观察。 镜检时光线不要太亮。 2. 加碘液染色制片观察。在高倍镜下，可以看见其表 皮是由不太规则的细胞群构成的，细胞中有着淡黄色 的细胞质。细胞壁很厚，着深黄色，壁上有小孔（纹 孔），孔里有细胞质丝穿过。 3. 用红墨水染色30 min，然后吸去多余的染料，加水封 片镜检，可见其细胞质被染成粉红色。也可观察到纹 孔和胞间连丝。
（四）实验结果
Байду номын сангаас
胞间连丝 连丝微管
胞间连丝
（五）实验报告
1 描绘所观察到的洋葱鳞叶细胞骨架图。 2 描绘所观察到的红辣椒细胞胞间连丝图。

一种非离子去垢剂，适当浓度的Triton X-100，破坏膜结构、 可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存。 （B）M－缓冲液: M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定，在M缓冲液中，其中咪唑 是缓冲剂， EDTA （乙二胺四乙酸）和 EGTA （乙二醇双醚四乙酸） 螯合 Ca2＋，并提供Mg2＋离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态 并且较为舒张，便于观察。 （C）磷酸缓冲液作用： 清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压； （D）戊二醛作用： 良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态； （E）考马斯亮兰作用： 非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。
实验七 细胞骨架的观察
考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝
一、实验目的


掌握观察植物细胞内微丝的方法。
了解观察动物细胞内微丝的方法。
二、实验原理

细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构， 按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和 中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、
运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。

实验的关键：
Triton X-100 抽提处理的时间很关键，如果
处理时间太短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，
会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；
如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维
断裂。
四、实验方法与步骤


1. 取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内 表皮作对照，大小1㎝2，放入盛有0.2mol/L磷酸盐缓 冲液[PBS]（pH6.8）的青霉素瓶中； 2. 吸去缓冲液，加入1％ Triton X-100处理洋葱内表 皮20-30 min； 3. 吸去Triton X-100，用M-缓冲液充分清洗3次，每 次3min； 4. 用3%戊二醛固定20min； 5. 用PBS清洗3次，每次10min； 6. 0.2％考马斯亮兰R250染色20-30min； 7. 用蒸馏水清洗1-2次； 8. 压片，镜检。 结果微丝束呈深蓝色

3%戊二醛用PBS配制
[实验步骤]
1、撕取洋葱鳞茎内表皮(约1平方厘米)置于3~5ml pH6.8 磷酸缓冲液中待其下沉(烧杯1) ；对照无 PBS处理；
2、用3~5ml 1%Triton X-100处理20 min(烧杯2) ； 对照无1%Triton X-100的M缓冲液处理20min;

3、吸去Triton X-100，用M缓冲液3~5ml洗2次，每 次5 min (烧杯3) ；对照无M缓冲液处理;
4、 3~5ml 3%戊二醛固定20 min(烧杯4) ； 5、pH6.8磷酸缓冲液3~5ml洗2次，每次5 min，滤
纸吸去残液(烧杯1) ； 6、 3~5ml 0.2%考马斯亮蓝R250染色15和30分钟，
然后用蒸馏水小心冲洗1～2次(烧杯5) ；做染色时 间的影响； 7、将表皮铺放在载玻片上，加盖玻片，在高倍显 微镜或者油镜下进行观察。
细胞骨架
洋葱表皮细胞骨架
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实验细胞骨架的观察
服从真理，就能征服一切事物
实验六 细胞骨架的观察
Triton X-100 SDS
[实验器材、材料和试剂]
➢ 光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染 色缸、载玻片、盖玻片；
➢ 新鲜洋葱;
➢ 6mM磷酸盐缓冲液 （pH6.8）、M缓冲液、 1%Triton X-100、 0.2%考马斯亮蓝R250、 3%戊二醛。

实验五 植物细胞骨架和胞间连 丝的观察
一、植物细胞骨架的光学显微镜观察 （一）实验目的 掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光 学显微镜下细胞骨架的网状结构。 （二）实验原理 细胞骨架定义： 狭义的细胞骨架（cytoskeleton）概念是指真核细胞中的蛋 白纤维网络结构。它所组成的结构体系称为 “细胞骨架系 统”，与细胞内的遗传系统、生物膜系统、并称 “细胞内的 三大系统”。包含三类蛋白纤丝？？
3 植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。
triton x-100 (聚乙二醇辛基苯基醚) ，中文名 为曲拉通 x-100，分子量为 647，常作为非离 子型表面活性剂（或称清洁剂）。它能溶解脂 质，以增加抗体对细胞膜的通透性。 免疫细胞化学中，triton x-100 常用浓度为1% 和0.3%，1% 的 triton x-100 常用于漂洗组织标 本，在水溶液中促进蛋白降解。0.3%的 triton x-100 则常用于稀释血清。
广义的细胞骨架概念是在细胞核中存在的核骨架-核纤层体 系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于 细胞核和细胞质的网架体系。
细胞骨架作用：
1 维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有 序性； 2 参与细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞 物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向 转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成 动力系统；在白细胞(白血球)的迁移、精子的游动、 神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关；
植物细胞用适当浓度的 TritonX—100 处理 后， 可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白 质却保存完好。 考马斯亮蓝 R250 (Coomassie brilliant blue R250) 是一种蛋白质染料，处理后的材料用考 马斯亮蓝 R250 染色后，用光学显微镜观察， 可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。