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简并引物的设计(课堂PPT)

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引物设计ppt

引物设计ppt
PCR引物设计
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算

《PCR引物设计》课件

《PCR引物设计》课件

04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引

PCR引物的设计公开课获奖课件

PCR引物的设计公开课获奖课件
引物设计
引物 引物旳主要性 引物设计旳原则 引物与PCR 引物设计软件 怎样使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析
引物（primers)
引物是人工合成旳两段 寡核苷酸序列，一种引 物与感爱好区域一端旳 一条DNA模板链互补， 另一种引物与感爱好区 域另一端旳另一条DNA 模板链互补。
改为vspace=PU便能够使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer
怎样使用Primer Premier 5.0
引物设计
– 一般引物设计 – 5’带酶切位点引物设计 – 巢式PCR引物设计 – 多重PCR引物设计
探针设计 引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较
– 尽量选择与非目旳基因同源性小旳序列作为 引物
– 选择3’端与非目旳基因不同源旳序列作为引 物
– 选择两个引物3’端与同一非目旳基因不同源 旳序列作为引物
– 假如3’端为富含G、C旳构造，只需3’端几种碱基 与模板互补结合，就可能引起延伸，造成假引起。
引物旳保守性与特异性
保守性：通用引物——检测同一类病原 微生物尽量多旳型别
特异性：防止非特异性扩增
扩增区域旳二级构造
模板DNA旳某些区域具有高度复杂旳二级构造， 在选择引物时，应使扩增区域尽量避开这些区 域。 – 扩增区域旳自由能（△G。）不大于 58.61kJ/mol
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
Antisense primer
引物旳主要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分主要旳 地位。PCR旳特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目旳DNA结合， PCR旳敏捷性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效旳延伸，可见引物设计好坏与 PCR成果亲密有关。

《引物设计教程》课件

《引物设计教程》课件
退火温度调整
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。

《引物设计教程》课件

《引物设计教程》课件

引物长度：通 常为15-30bp， 过长可能导致 非特异性扩增
引物GC含量： 尽量控制在 40-60%，避
免形成二级结 构
引 物 Tm 值 ： 应接近目标序 列 的 Tm 值 ， 以提高扩增效
率
引物3'端：避 免形成发卡结 构，以免影响
扩增效果
引物特异性： 确保引物与目 标序列具有高 度特异性，避 免非特异性扩
增效率和稳定性
引物3'端：避免3'端 出现连续3个或以上 的碱基，以降低错配
率
引物二级结构：使用 软件预测引物二级结 构，避免形成发卡结 构，提高扩增效率
引物特异性：通过 BLAST比对，确保引 物特异性，避免非特
异性扩增
引物浓度：优化引物 浓度，以提高扩增效
率和稳定性
引物纯度：确保引物 纯度，避免污染和降 解，提高扩增效率和
引物GC含量：尽量保持 50%左右，避免过高或 过低
引 物 Tm 值 ： 确 保 引 物 Tm 值在55-65℃之间，以提 高扩增效率
引物特异性：确保引物与 目标序列具有高度特异性， 避免非特异性扩增
引物错配：避免引物内部 错配，以提高扩增效率和 准确性
引物设计软件：可使用 Primer3、OligoT等软 件辅助设计引物
引物设计不当导 致扩增失败
引物设计不当导 致非特异性扩增
引物设计不当导 致扩增效率低
引物设计不当导 致扩增产物长度 不均一
引物设计软件：选择 合适的引物设计软件， 如Primer3、Primer-
BLAST等
引物长度：确保引物 长度在18-25bp之间， 以提高特异性和扩增
效率
引物GC含量：保持 引物GC含量在4060%之间，以提高扩

NCBI基本功能与引物设计PPT课件

NCBI基本功能与引物设计PPT课件
9
Blast简介
BLAST ： “局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool) 的 缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。
主要的Blast程序：
程序名 Blastn
查询序列 核酸
Blastp
蛋白质
数据库 核酸
蛋白质
搜索方法 核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列
CCNGTNAAYGGNAAYGGNAARYCAR
下游 P V N G N G K Q
C or T/U
1. 根据密码子表建立引物系列
http://www.kazusa.or.jp/codon/
2. 谨慎使用次黄嘌呤
29
➢简并引物设计过程
传统方法（适用于保守度高序列） • 应用BLAST进行同源序列搜索 • 应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸） • 简并引物设计原则 • Primer5和Oligo6进行引物分析 CODEHOP法（适用于保守度低序列）
蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列
Blastx Tblastn TBlastx
核酸 蛋白质
核酸
蛋白质 核酸 核酸
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据 库中的序列逐一搜索。
蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译 后的蛋白质序列逐一比对。
核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据 库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐一 进行比对。
1.登陆NCBI——Blast——Primer-BLAST: /
25
以文献报道鸡的MUC2的引物为例：
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27
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简并引物设计
Symbol Definition

PCR引物设计原理 ppt课件

PCR引物设计原理 ppt课件

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点击 2020/12/22 Search，进行引物搜索
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Primer Length常设置在18－30bp, 短了特异性不好，长了没有必要。 当然有特殊要求的除外，如加个酶 切位点什么的。
PCR Product size最好是100－ 500bp之间，小于100bp的PCR产 物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模 糊，不好看。至于上限倒也不必要 求苛刻。
2020/12/22
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（3）重复或自身互补序列：
• 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复 性。
2020/12/22
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（4）上下引物的互补性：
• 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任 何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二 聚体。
• 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端 都不能和 其他任何引物互补。
➢ 3’末端的性质非常关键。
➢ 如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最 好不要A，或AA等多聚A；
➢ 但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列 的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。
2020/12/22
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• 当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大 降低；
PCR引物设计原理
2020/12/22
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➢ PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的 延伸
2020/12/22
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精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我

简并引物的设计(课堂PPT)

简并引物的设计(课堂PPT)
• 充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率 高的密码子，以降低引物的简并性。
• 引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说， 意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。
• 在简并度高的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。
2
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谢谢观赏
16
GeneFisher2
• 对引物的修饰
降低简并度的方法：
通过密码子偏好选择合适的碱基
通过用次黄嘌呤代替简并度高的碱基
2
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2020/4/24
13
பைடு நூலகம்020/4/24
14
简并引物设计原则
• 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。如甲硫氨 酸和色氨酸均只有一个密码子。尽可能不用含有亮氨酸、 精氨酸、丝氨酸的肽段。
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进 行多序列比对
• 确定合适的保守区域
设计简并引物至少需要上下游各有一个保 守区域，且两个保守区域相距50～400个氨 基酸为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间， 最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基 酸。
2
4
• 利用软件设计引物
Primer 5.0 支持简并引物的设计 在线设计：CODEHOP
际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部 分还是相同的，称之为简并引物。
2
2
简并引物设计方法
• 利用NCBI搜索不同物种中同一目的基 因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。
因为不同物种的密码子偏好问题，不同的 核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的， 所以氨基酸序列才是真正保守的。
2
3
• 对所找到的序列进行多序列比对
简并引物的设计
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GeneFisher2
• 对引物的修饰
降低简并度的方法： 通过用次黄嘌呤代替简并度高的碱基 通过密码子偏好选择合适的碱基
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• 利用软件设计引物
Primer 5.0 支持简并引物的设计 在线设计：CODEHOP
GeneFisher2
• 对引物的修饰
降低简并度的方基
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简并引物设计原则
• 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。如甲硫氨 酸和色氨酸均只有一个密码子。尽可能不用含有亮氨酸、 精氨酸、丝氨酸的肽段。
• 充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率 高的密码子，以降低引物的简并性。
• 引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说， 意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。
• 在简并度高的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。
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谢谢观赏
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际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部 分还是相同的，称之为简并引物。
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简并引物设计方法
• 利用NCBI搜索不同物种中同一目的基 因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。
因为不同物种的密码子偏好问题，不同的 核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的， 所以氨基酸序列才是真正保守的。
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• 对所找到的序列进行多序列比对
简并引物的设计
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简并引物
• 简并引物：是克隆未知基因的一种引物设计方案。简
并引物的出现是出于遗传密码的简并性。有时需要根据一 段氨基酸的保守序列反推到DNA 水平设计引物。由于大多 数氨基酸的遗传密码不止一种，因此，由氨基酸序列反推 DNA 序列时，就遇到部分碱基的不确定性。这种不确定性 因物种或细胞亚结构的不同而异，这样设计出来的引物实
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进 行多序列比对
• 确定合适的保守区域
设计简并引物至少需要上下游各有一个保 守区域，且两个保守区域相距50～400个氨 基酸为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间， 最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基 酸。
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• 利用软件设计引物
Primer 5.0 支持简并引物的设计 在线设计：CODEHOP