PCR引物设计 PPT课件

04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引

退火温度调整
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。

❖ 先调整 premer5 的flie 的 pr源自ferences 的 默认碱基长度
❖ 4、要设计两条链的引物，Sense链和AntiSense链，注意上下游引物： Sense链是上游 引物， Anti- Sense链是下游引物（如何判断）
❖ 5、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物 长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基
❖ 其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条 件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，
❖ 有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复 性条件最佳。
❖
❖ Tm温度过高过低会出现问题
❖ 7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的 互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物 间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
❖ 8.引物的3’端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何
修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能， 引物3′端不能发生错配。
❖ 9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩
第三章4 pcr引物设计 ppt课件
十条PCR引物的设计原则总述
❖ ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ❖ ② 产物不能形成二级结构。（如何避免） ❖ ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？） ❖ ④ G+C含量在40%~60%之间。 ❖ ⑤ 碱基要随机分布。 ❖ ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体） ❖ ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ❖ ⑧ 引物5’端可以修饰。 ❖ ⑨ 引物3’端不可修饰。 ❖ ⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。

ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。

指DNA双链形成 所需的自由能，该值反映了双链结构内部 碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值 较低(绝对值不超过9)，而5'端和中间ΔG值 相对较高的引物。引物3’ 端的ΔG值过高， 容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
•
(10)密码子的简并。例如，在扩增编码区 域，引物3'端不要终止于密码子的第3位， 因为密码子的第3位易发生简并，会影响扩 增特异性与效率。
• (4)引物的互补情况。引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR反应失败，因此应尽可能避免引物互补情况的发生。 引物自身不具有互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状 结构造成引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影 响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续 互补碱基不能大于3bp；两引物之间不应具有互补性，尤 其应避免3，端的互补重叠以防引物二聚体的形成，一对 引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。如果由 于互补形成的引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过 4.5kcal／mol)，则易导致产生引物二聚体带，并且降低引 物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
引物设计
•
自从1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR技术因具有特异、灵 敏、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优 点，很快得到了广泛的应用。目前，PCR已经成为分子生 物学领域最基本、最重要的技术手段之一。引物设计是 PCR技术中至关重要的一环，寻找一对合适的核苷酸片段 作为引物，使其有效地从模板DNA序列扩增目的片段， 是PCR反应成功的保障。
3．引物设计软件
• 目前，最常用的引物设计软件为Primer Premier 5.0和在线工具Primer 3。另外， NCBI新开发了一款引物设计在线工具 “Primer-BLAST"。

引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。 G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于 从模板上解离。 G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特 异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。
引物设计的基本原则
5、Tm值之差应小于1℃，最适退火温度 在55-60℃。
1.避免PCR试剂的污染 2.最适合的反应条件 3.设置对照组：
①PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。 ②PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片
段代替目的模板。
③PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功
进行特异性扩增的模板。
常见问题
1.为什么完全没有PCR扩增产物？
①试剂质量问题或者加样时出错，导致反应 体系不完整。 ②聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。 ③PCR仪温度控制不精确。 ④模板DNA发生降解。 ⑤引物或反应温度设计不合理 ⑥靶片段GC含量过高或扩增对象长多
分子内互补、发夹结构、分子间互补。 二级结构会这家引物与模板杂交以及 PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区 域。 用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
普通PCR仪
温度梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
引物设计的目的
为了找到一对合适的核苷酸片段， 使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物是PCR特异性反应的关键，同 时也与PCR扩增的效率密切相关。 引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽

Accept the edit result Return to the main window
Results Report
其他功能
限制性内切酶分析
酶切胶回收产物鉴定
1 M 2 1 M 2
1：C260酶切胶回收（I） M：100bp DNA ladder 2：C260酶切胶回收（II）
3000 bp 2000 bp
b 5’
2
b
5'
3’
22
23
引物设计的原则
三条最基本的原则：
• 引物与模板的序列要紧密互补
• 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹 结构 • 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反 应(即错配)。
主要影响因素
• • • • • • • 引物长度 产物长度 序列Tm 值 引物与模板形成双链的内部稳定性 形成引物二聚体及发夹结构的能值 在错配位点的引发效率 引物及产物的GC 含量
• 引物的作用
基因获得，测序以及检测等。
DNA 合成
• 底物：dNTP • DNA聚合酶
• 不能从头合成 • 有方向性 5' 3'
• 模板 • 引物
• 引物配对
• 上游引物 F • 下游引物 R 5' 5' 3' 3'
• 为什么要用一对引物呢？
• 限定产物位置和大小 • 产生指数扩增
a 3’ 5' 5’ d a c 5’ 5’ 3’ d 5’ c 3’ 3' 5'
• 引物应具有特异性
引物设计完成以后，应对其进行Blast检测，如果与其他基因不具有 互补性，就可以进行下一步实验了。
当然，各种模板的引物设计难度不一，有的模板本身条件 比较困难，例如GC含量偏高或者偏低，导致找不到各种指 标都十分合适的引物，用作克隆目的的PCR，由于片段相 对固定，其引物设计的自由度较低，所以这时候，只要尽 量满足这些条件就可以了。

(1)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应
引物b与上链相同，是G
的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的
碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是
AGA UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点表 示突变部位的碱基，引物b中该部位的碱
基是__G____，引物c该部位的碱基是__C____。
PCR中需要引物的原因是
引物的设计：引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 ①引物的5’端能与模板链的3’端进行碱基互补配对
②引物之间或引物内部，不能发生互补配对
⑤
⑥
5`
①
② 3` 5`
3`
目的基因
3`
③
④
5`
⑦
⑧
扩增目的基因用： 扩增目的基因两侧的序列用： 检测目的基因是否正向插入载体用：
②③ ①④ ③⑥
让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。 对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE 三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进
行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者
免疫缺陷产生的机制是
。
IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶 活力降低，不利于免疫细胞的分化
如下图1所示。回答下列问题：
(2)从P2，P3两种引物的角度分析，LTB和
ST1基因能够融合的关键是R1和PCR2
不能在同一个反应体系中进行，原因是： 引物之间的结合会干扰引物和模板链
(3的)②结过合程，从而影（响填PC“R需过要程”或“不需要
”）加入引不物需，要原因是
。
两条母链的起始段位置的碱基序列即为引 物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚 合酶提供3'端

4.为什么PCR产物出现片状拖尾？
①DNA聚合酶过多或酶活性差。 ②dNTP和Mg2+浓度过高。 ③退火温度过低，PCR循环数偏多。 ④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 ⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特异扩增。
2021/3/7
CHENLI
22
2021/3/7
普通PCR仪
CHENLI
温度梯度PCR仪
对于20bp左右的引物：
2021/3/7
Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引
物Tm值低5℃左右。
CHENLI
32
引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
2021/3/7
CHENLI
36
引物设计的基本原则
10、引物3’端要避开密码子的第3位。
如扩增序列位于基因编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第3位，因密码子的 第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与 效率。
2021/3/7
CHENLI
37
Real-Time PCR引物设计原则
1、避免重复碱基，尤其是G。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生 物素、引入点突变等。
由于延伸是从3’端开始的，所以不能进 行任何修饰。
2021/3/7
CHENLI
35
引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。