百泰派克生物科技
GST pull-down实验
GST pull-down实验原理
Pull-down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull-down技术利用被亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）标记的已知的蛋白特异性识别混合体系中的配体蛋白，以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
当诱饵蛋白被谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记时进行的Pull-down实验，称为GST
pull-down实验，也称GST pull-down融合蛋白沉降技术。GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来发掘未知的蛋白或肽的相互作用。
GST pull-down实验应用
了解蛋白质间的相互作用可进一步探究某项生理活动的分子机制，GST pull-down技术在研究不同生物体内蛋白相互作用方面得到了广泛的应用。GST pull-down技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)可对相互作用蛋白进行定性定量分析，研究蛋白互作网络及由此介导的信号通路和调节机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的GST pull-down蛋白互作分析一站式服务，后续基于液质联用技术（LC-MS/MS）对IP、Co-IP样品及GST融合蛋白Pull-down等纯化样本中的蛋白/蛋白混合物的质谱鉴定。欢迎免费咨询152-****7680。
Co-IP结果如何看？_Co-IP（免疫共沉淀）与GSTpull-down区别
Co-IP是检测分⼦间相互作⽤的常⽤技术，德泰发现有很多实验⼈员反映在查看论⽂⽂献的过程
中，遇到Co-IP实验结果图不知道如何进⾏分析。本⽂从不同的⽂献中找了四个Co-IP的结果
图，⽤案例的⽅式对如何分析Co-IP实验结果图进⾏介绍。
Co-IP结果如何看？
⾸先需要说明的是，熟悉了解免疫共沉淀实验的原理及实验的操作流程是进⾏Co-IP结果图分析
的前提。在清楚知道Co-IP操作流程的前提下，弄清楚图中各个部分所代表的实验步骤，结合图
中展⽰的结果进⾏分析，便可以看懂Co-IP的实验结果图。
Co-IP结果分析案例⼀
该图为验证蛋⽩EDR1与蛋⽩EDR4之间是否存在相互作⽤的结果图。由图中可以得到，蛋⽩EDR4带有GDP标签，蛋⽩EDR1带有FLAG标签，该实验为利⽤蛋⽩标签来沉淀和检测蛋⽩；
该co-ip实验实验被分为两组，第⼀组存在GFP标签及EDR1-FLAG蛋⽩，第⼆组存在EDR4-GFP蛋⽩及EDR1-FLAG蛋⽩；图中共有三组胶图，分别是Inut组，IP组，以及CO-IP组。基本
情况得到之后，开始进⾏分析：
观察图⽚的顺序为Co-IP实验操作顺序相同。⾸先观察Input组，即阳性独照组。第⼀块胶图为利
⽤anti-FLAG沉淀FLAG标签，发现两个条带都在130kd处有蛋⽩，说明两组实验都存在EDR1-FLAG蛋⽩且其⼤⼩为130kd，第⼆块胶图为利⽤anti-GFP标签沉淀GFP标签，发现第⼀条带在
25kd存在蛋⽩⽽第⼆条带在130kd存在蛋⽩，说明第⼀组实验存在GFP标签，且⼤⼩为25kd，
第⼆组实验存在EDR4-GFP蛋⽩且⼤⼩为130kd。随后观察IP组，该组图表⽰的是利⽤anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋⽩进⾏沉淀，图上显⽰两组实验在130kd都存在蛋⽩，说明两组实验的
EDR1-FLAG被沉淀下来。最后观察CO-IP实验组，该组图表⽰在IP组的基础上进⼀步利⽤anti-
gstpulldown实验流程
GST pull down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上，与溶液中的目的蛋白相结合。可用来确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用。先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上，再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育，这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，即GST pull
down产物。这种互作复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定出未知蛋白。辉骏生物可制备GST融合蛋白，多种GST pulldown蛋白互作方案供客户选择，保证GST融合蛋白沉降技术服务到成功发表文献。
糖代谢异常是癌症的突出特征，作者前期研究发现肝细胞癌(HCC)中的糖原含量降低，并与患者总体生存情况不良相关。探索HCC中的异常糖代谢机制或许可以为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。
>RNA-seq和qPCR等结果显示HCC组织中的GYS2(糖原合成酶2)显著下调，并与患者不良预后相关
>细胞和小鼠实验表明GYS2的缺失促进了肝癌细胞增殖和肿瘤生长
>GYS2敲除细胞的RNA-seq实验发现p53通路都受到明显抑制
>Co-IP和 GST pull down证明GYS2通过与p53的直接相互作用发挥肿瘤抑制功能
>CO-IP和GST pull down实验发现GYS2、p53和E3泛素连接酶MDM2相互作用形成复合体，GYS2与p53竞争结合MDM2来抑制p53泛素化，稳定p53蛋白水平
>荧光素酶和ChIP等实验表明p53蛋白结台GYS2启动子，通过p300介导的乙酰化，在转录水平上抑制GYS2
>对HBV阳性肝中的关键致癌蛋白HBx的研究发现,HBx、HDAC1与乙酰化的p53相互作用,共同抑制了GYS2
本研究首次报道了HCC组织中糖原含量显著降低，并与不利的患者预后相关，这归因于新发现的HBx/GYS2/p53信号轴。低表达的GYS2促进HCC细胞增殖而非迁移，并提供了两条独立的证据线来支持GYS2和p53之间的关系。一方面，GYS2与MDM2竞争结合p53，以稳定p53免于蛋白酶体降解；另一方面，p53以负反馈方式抑制GYS2表达和糖原含量。这些数据表明p53和GYS2可能通过平衡彼此的表达而在HCC中发挥功能。
1 蛋白相互作用Pull-Down实验
实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。
用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。
2 实验准备：
实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、
实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液
实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KCl
SDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT
裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））
实验方法：
方法一：
1、预清除细胞裂解液：
将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。
离心机12,000g在4℃离心2min。
将上清转移至新的离心管中。
2、探测细胞裂解液
两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在4℃翻转混合孵育2h。
