蛋白纯化和GST沉降技术

蛋白纯化和GST沉降技术

【原理】

细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用 。

【应用】

1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用

2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用

【方法】

一、GST融合蛋白的纯化

1、菌种的活化：按1%的量在螺旋管中活化所需菌种，一般50ul的冻存菌接入5ml的LB中，37℃ 220rpm培养

2、活化的菌种转接1%接种于5mlLB中，37℃ 220rpm培养至OD≈0.4~0.6 之间，即到达对数生长时期（大约3~4小时）

3、取1ml菌液测定OD值，至OD≈0.4~0.6 之间，则取诱导前1ml，其余的按1/1000加入诱导剂IPTG ，低温小量诱导30℃ 200rpm，诱导过夜（小于16hr）

4、次日取诱导后1ml，诱导前和诱导后各1ml，12000rpm ，离心2mins，弃上清，加适量的1*PBS,重悬菌液，再加1* loading buffer，混匀，沸水煮10mins, 12000rpm ，离心2mins，SDS-PAGE电泳考马氏亮兰染色

5、如果考染结果显示GST融合蛋白（GST-X）诱导出来，则做大量诱导

6、菌种活化后按1%转接种于100ml LB中，30℃ 200rpm 扩大培养至OD≈0.4~0.6 之间，即到达对数生长时期（大约3 小时）

7、取1ml菌液测定OD值，至OD≈0.4~0.6 之间，按1/10000 加入诱导剂IPTG ，低温诱导20℃ 180rpm，制冷系数0.5 ，诱导过夜

8、次日50ml离心管收菌, 4℃ 5000rpm 5mins 离心，每瓶100ml重复离心收于同一离心管中，大型离心机提前预冷

9、每100ml 菌液沉淀加入10ml A 液重悬

10、 超声破碎。大探头，冰浴，频率5~10。超声2~3s停2~3s, 15~20次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止

11、 超声后的细菌裂解液加入到50ml 干净离心管中，4℃ 11000rpm

10mins离心

12、 平衡Agrose-beads. 每个干净EP管中加50ul Agrose-beads。再加1ml

A 液，4℃ 旋转 2~3mins后4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃上清，重复3次

13、 吸取菌液离心上清到50ml 干净离心管，将平衡好的Agrose -beads加入4℃ 旋转 4小时左右

14、 4℃ 3000rpm/600 g 10mins 离心。移液管吸弃上清，留有1ml左右时用移液器枪头混匀X-GST-beads，转移至1.5 ml进口 EP 管中，用A 液反复洗50ml 离心管多次至将全部珠子转移至EP 管中。3000rpm/600 g ,

5mins,离心,弃上清

15、 A 液洗涤X-GST-beads，每次1ml 4℃ 旋转 10mins后4℃

3000rpm/600 g , 5mins, 离心，吸弃上清，重复3次

16、 最后向X-GST-bead 中加入100 ul A 液，4℃ 保存

17、 考染定量 ：取2ul GST-beads 加入 10 ul 1* loading buffer 混匀，沸水煮样10mins 。12000rpm 5mins 离心后取上清上样 （SDS-PAGE）。下胶后，考马氏亮兰染色（新考染液2~3 mins，旧的考染液10~30mins ）,脱色2 h左右

二、GST Pull down

1、转染细胞24 小时后，IP buffer裂解，超声破碎。大探头，冰浴，频率5~10。超声2~3s停2~3s, 15~20次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止，12000rpm, 离心2mins, 取上清作样品，取部分作In put,剩下的作GST Pull

down

2、根据定量结果取X-GST-beads 加入到IP buffer 平衡，4℃ 旋转 2~3mins后4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃上清，重复3次。然后将平衡后的珠子于600ul cell lysis结合孵育4h~过夜

3、4℃ ，3000rpm/600 g ， 5mins 离心后吸回裂解上清，IP buffer洗珠子，4℃ 旋转 10mins后，4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，2~3次。最后用微量上样器将全部IP buffer吸弃。

4、向X-GST-beads其中加入30 ul 1* loading buffer.

细胞裂解液In put 50 ul 中加入 50 ul 2* loading buffer . 沸水10mins 。12000rpm 5mins 离心后取上清上样进行 SDS-PAGE

5、电泳后进行Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白；也可以将胶考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白。

【注意事项】

1） 该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行

2） 沸水煮样以前的离心速度不要超过3000rpm，否则可能将beads离碎了。

3） 在检测时如果发现GST对照组也有目的蛋白时，则表明有非特异的结合，这是我们应当在GST Pull down的第三步多洗几次。

4）GST对照蛋白的量和实验组的蛋白的应该一样，最好是对照的量比实验组的多一点

【举例】

GST pull down验证两种已知蛋白质的相互作用

input GST

Y-GFP + + + X-GST

Y-GFP X-GFP + + + GST input

Anti-GFP Anti-GFP Y-GST

X-GFP

2 免疫共沉淀

图 2 免疫共沉淀（co-IP）示意图

（1）原理

1）当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 （图2）。

2）缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用

（2）方法

1） 转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，取少量裂解液以备Western blot分析做Input, 剩余的裂解液以最大转速离心10 min后取上清，

2） 取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液（一般1ML/管）平衡3 次，每次3,000 rpm离心5 min，

3） 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育1h，进行预沉淀。

4）3000rpm离心后收集上清，将沉淀弃去，上清备用，

5）加1μg相应的抗体加入到4）的上清液中，4°C缓慢摇晃孵育1h(也可过夜)，

6） 取10μl protein A/G 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液（一般1ML/管）平衡3 次，每次3,000 rpm离心5 min，

7） 将预处理过的10μl protein A/G 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过的细胞裂解液中, 4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A/G琼脂糖珠偶连,

8） 免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心5 min，将琼脂糖珠离心至管底。将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次。最后加入15μl-30μl的1×SDS 上样缓冲液，沸水煮10分钟, 9） SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

（3）注意的问题

1）细胞裂解

采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质

相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。一般如果相互作用很弱时可以考虑将盐浓度尽量降低，同时可以考虑加入铰链剂。

不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktail。

2） 使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用，抗体的用量参考抗体使用说明书。

3）使用对照抗体：

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：正常兔IgG

4） 在检测时如果发现对照组也有目的蛋白时，则表明有非特异的结合，这是我们应当在8）步多洗几次。

5）所有操作均在4°C进行。

举 例

免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用

Y-GFP P Y-GFP GFP Y-GFP +X-HA

IP: HA GFP

-GFP

-GFP -GFP -HA

-HA -HA X-HA

input input IP: HA IgG

Y-GFP