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柱前衍生高效液相色谱法测定灵芝孢子粉中氨基酸的含量

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中国中西医结合外科杂志2021年4月第27卷第2期182

柱前衍生高效液相色谱法测定

灵芝孢子粉中氨基酸的含量

殷娇阳1，阎　姝2，田书霞2

摘要　目的：建立用于测定灵芝孢子粉中氨基酸含量的柱前衍生化高效液相色谱方法。方法：采用邻苯二甲醛（OPA）和9-氯甲酸芴甲酯（FMOC）联用对灵芝孢子粉中的氨基酸进行衍生，色谱条件为：Advance Bio AAA（100 mm×4.6 mm， 2.7 μm）色谱柱，流动相A为0.01 mol/L磷酸氢二钠和0.01 mol/L硼酸钠溶液，pH值为8.2±0.1，流动相B为甲醇︰乙腈︰水（45︰45︰10）。流速：0.8 mL/min，柱温：45 ℃，进样量：10 μL，检测波长：338 nm和262 nm。结果：灵芝孢子粉中检测的17种氨基酸在60 min内分离良好；在一定范围内线性关系良好(r≥0.999，n=6)；加样回收率为95.42%~99.38%，实验方法的精密度、重复性和稳定性的相对标准偏差（RSD）均小于3.0%。结论：经方法学验证显示，本研究所建立的实验方法适用于灵芝孢子粉中17种氨基酸的含量测定。关键词：灵芝孢子粉；高效液相色谱法；氨基酸；衍生化中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1007-6948(2021)02-0182-07doi：10.3969/j.issn.1007-6948.2021.02.004

Assay of Amino Acids in Ganoderma Lucidum Spore Powder by Pre-column Derivatization HPLC YIN

Jiao-yang, YAN Shu, TIAN Shu-xia School of Pharmacy, Tianjin Medical University, Tianjin (300070), ChinaAbstract: Objective　To establish a pre-column derivatization-high performance liquid chromatography

method for the determination of amino acids in ganoderma lucidum spore powder.　Methods　The amino acids in

ganoderma lucidum spore powder were derivatized with o-phthalaldehyde (OPA) and 9-fluorenylmethoxycarbonyl

chloride(FMOC). The chromatographic conditions were Advance Bio AAA (100 mm×4.6 mm, 2.7μm) column,

and Mobile phase A was 0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate and 0.01 mol/L sodium borate solution (pH:

8.2±0.1). Mobile phase B was methanol: acetonitrile: water (45:45:10), flow rate was 0.8 mL/min, the column

temperature was 45 ℃, the injection volume was 10 μL and the detection wavelength was fixed at 338 nm and

262 nm.　Results　17 amino acids in Ganoderma lucidum spore powder were separated satisfactorily in 60

minutes. All the components exhibited good linear correlation in the given concentration range (r≥0.999, n=6).

The recovery rate of the sample was between 95.42% and 99.38%. The RSD of the precision, repeatability and

stability of the experimental method were all less than 3.0%.　Conclusion　The methodological verification

shows that the established experimental method is suitable for the determination of 17 amino acids in ganoderma

spore powder.Key words: Ganoderma lucidum spore powder; HPLC; amino acid; derivatization

灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实

体，灵芝药用在我国已有几千年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品[1]。

中医四大经典著作之一的《神农本草经》将灵芝

归属为上品药，称其“主养命以应天，无毒，多

服久服不伤人”[2-3]。亦在《本草纲目》中记载：“灵

芝性平，味苦，无毒，主胸中结，益心气，补中，

增智慧，不忘，久服轻身不老，延年神仙”。灵芝

对心、肝、脾、肺、肾等具有补益作用，其子实体、

孢子粉均可入药[4]。灵芝孢子粉是灵芝在生长期 基金项目：天津市科技计划项目（18ZXXYSY00130）；天津市“131”创新型人才团队资助项目1.天津医科大学药学院（天津 300070）2.天津市南开医院药学部（天津 300100）通信作者：阎 姝，

E-mail:133****************论 著中国中西医结合外科杂志2021年4月第27卷第2期183

释放出来的咖啡色的种子去壁后制得，经研究证

实，灵芝孢子粉具有灵芝的全部遗传物质，药用

价值远高于灵芝的子实体[5-6]。近年来，随着现代

孢子体破壁技术的不断发展，灵芝孢子粉的研究

与应用取得了长足的进步。现代研究发现灵芝孢

子粉具有增强机体免疫力[7]，调节血糖[8]，控制

血压[9]，清除自由基，抗衰老[10]，抗肿瘤[11]等

功效。灵芝孢子粉的有效成分包括灵芝多糖、三

萜类、核苷类和多种氨基酸等，研究者对灵芝生

物活性成分的研究已经持续了数十年，其中大部

分集中在三萜酸和多糖上[12-14]，而中药发挥作用

具有多成分多靶点的特点，仅通过一两个指标的检

测并不能全面反映其整体质量。灵芝孢子粉这类

滋补型中药氨基酸含量十分丰富，并且氨基酸作

为组成蛋白质的基本单元，是治疗疾病和滋补营

养的主要成分，在提高人体免疫力，促进消化吸收，

补充大脑营养，延缓衰老等方面发挥着重要作

用[15-16]。因此，测定灵芝孢子粉中氨基酸的种类

和含量对灵芝孢子粉的开发和利用具有十分重要

的意义，同时氨基酸的含量测定可以使药品有效

性控制进一步完善，质量评价时应多考察该指标

成分。

目前，灵芝孢子粉中氨基酸含量的研究分析

仍处于初级阶段，仅有几篇通过氨基酸分析仪测

定灵芝孢子粉中氨基酸含量的报道，而氨基酸分

析仪价格昂贵，结构复杂，分析时间长，仪器的

专属化致其应用较为局限[17]。近年来，随着氨基

酸衍生化技术和检测器的不断发展，高效液相色

谱(HPLC)检测结果的准确度和精确度都有了很大

的提高和改善，成为目前使用最为广泛的检测方

法。本研究采用邻苯二甲醛（OPA）和9-氯甲酸

芴甲酯（FMOC）联用柱前衍生高效液相色谱法，

可同时检测一级氨基酸和二级氨基酸，且衍生试

剂OPA与FMOC和氨基酸在30 s内即可反应生成

具有强烈紫外吸收的衍生物，可实现高效液相色

谱仪自动化在线衍生检测，该方法不仅反应速度

快，操作简单，灵敏度、准确度也较高，且未见

此法在灵芝孢子粉氨基酸测定中的应用。一些研

究表明，OPA-FMOC在线衍生方法只适合低浓度

的氨基酸样品含量的测定，可能存在衍生试剂反

应量不足等现象[18]，而在灵芝孢子粉的含量测定

中，精密度、重复性、稳定性、加样回收率实验，

二级衍生化氨基酸结果均较好，可以为灵芝孢子

粉中氨基酸的质量评价提供新方法。1　材料与方法1.1　仪器与试剂药材　Agilent 1100高效液相色

谱仪（配备G1379A在线脱气机，G1311A四元

梯度泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G13158B DAD检测器，Agilent色谱工作站）；

BP211D十万分之一天平（德国赛多利斯公司）；

KQ-700GDV超声波清洗器（昆山市超声仪有限公

司）；DHG101-4A电热恒温鼓风干燥箱（上海予

华仪器设备有限公司）。氨基酸对照品：天冬氨酸

（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、

甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、

丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys-Cys）、

缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、

亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、

脯氨酸（Pro）、OPA、FMOC及3-巯基丙酸均购

自美国Sigma公司，纯度≥98%。乙腈、甲醇（北

京Dikma公司），其他均为国产分析纯。去壁灵芝

孢子粉（浙江寿仙谷医药股份有限公司），水为超

纯水。1.2　溶液的制备

1.2.1　试剂的制备　1）40% NaOH溶液配制：

取NaOH 10 g，加水溶解并稀释至25 mL。2） 0.4 mol/L pH值10.4的硼酸盐缓冲液：取硼酸约

2.473 g，溶于100 mL水中，加NaOH溶液调至

pH值为10.4±0.1。3）OPA衍生化试剂：约8 mg

OPA，加入0.4 mol/L硼酸盐缓冲液0.7 mL，加乙

腈0.1 mL，3-巯基丙酸12.5 μL，混匀，过滤，4 ℃

保存备用。4）FMOC衍生试剂：取FMOC 10 mg，加2 mL乙腈溶解即得，4 ℃保存备用。5）

空白溶液：0.1 mol/L盐酸溶液。1.2.2　混合对照品溶液　精密称取17种氨基酸对

照品各100 mg（必要时需折算），分别置于10 mL

量瓶中，用配置好的0.1 mol/L盐酸溶液溶解并

定容至刻度，摇匀，制得各单一成分对照品储备

液。准确移取各对照品储备液适量，用0.1 mol/L

盐酸溶液稀释并定容至50 mL量瓶中，作为混

合对照品储备液，天冬氨酸、谷氨酸质量浓度为 0.42 mg/mL，精氨酸、丙氨酸和缬氨酸质量浓度

为0.24 mg/mL，组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸为 0.08 mg/mL，胱氨酸为0.02 mg/mL，其余8种氨

基酸的质量浓度为0.16 mg/mL。精密量取混合对

照品储备液2 mL置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L

盐酸至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。1.2.3　供试品溶液　取样品粉末约100 mg，精密称

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柱前衍生高效液相色谱法测定太子参中精氨酸的含量

柱前衍生高效液相色谱法测定太子参中精氨酸的含量

论著　

Ｉ　ａｔｉｓ　中国民族民间医药　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　ｅｔｈｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｙ　・７・　

柱前衍生高效液相色谱法测定太子参中精氨酸的含量　

王欣美王柯　季申　上海市食品药品检验所，上海２０１２０３　

【摘要】　目的：建立太子参药材中精氨酸的含量测定方法。方法：样品用０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸一乙醇（９：１）混合溶液提取，采用邻苯　二甲醛（ＯＰＡ）与一氯甲酸芴甲酯（ＦＭＯＣ）联用全自动柱前衍生化，Ｈｙｐｅ￣ｉｌ　ＯＤＳ柱，波长为３３８ｎｍ，检测太子参药材中精氨酸的含量。　结果：精氨酸在０．２—４１ｘｇ范围内呈良好的线性关系，平均回收率为１０１．２％。结论：本方法灵敏、准确，快速，具有良好的重复性和稳定　性，可用于太子参中精氨酸的含量测定。不同产地来源、不同批次太子参中的精氨酸含量存在一定差异。　【关键词】　太子参；氨基酸；柱前衍生；ＨＰＬＣ　【中图分类号】Ｒ９２７　【文献标志码】Ａ　【文章编号】１００７—８５１７（２０１３）１９—０００７—０３　

Ｐｒｅ——ｃｏｌｕｎｍ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ＲＰ——ＨＰＬＣ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｉｎＰｓｅｕｄｏｓｔｅｌｌａｒｉａ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ　

Ｗａｎｇ　Ｘｉｎｍｅｉ　Ｗａｎｇ　Ｋｅ　Ｊｉ　Ｓｈｅｎ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｈａｎｇｈｍ，２０１２１０　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ａｎ　Ｐｒｅ—ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ＲＰ—ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｉｎ　Ｐｓｅｕｄｏｓｔｅｌｌａｒｉａ　ｈｅｔ—　ｅｒｏｐｈｙｌｌａ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　０．１　ｍｏｌ／Ｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｃｉｄ—ａｌｃｈｏｈｏｌ（９：１）ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅ—ｃｏｌｕｍｎｌｙ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｏ—ｐｈｔｈａｌｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＯＰＡ）ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ（ＦＭＯＣ）ａｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ａｔ　３３８ｎｍ．Ｒｅ－　ｓｕｉｔ：Ｔｈｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｗａｓ　ｉｎ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍＯ．２—４１ｘｇ（ｒ＝０．９９９９．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｗａｓ　１０１．２　（ｎ＝６）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｈｏｒｔ—ｔｉｍｅ—ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｉｎ　Ｐｓｅｕｄｏｓｔｅｌｌａｒｉａ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｖａｒｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｐｌａｃｅｓ　ａｎｄ　ｂａｔ－　ｃｈｅｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｓｅｕｄｏｓｔｅｌｌａｒｉａ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ（Ｍｉｑ．）Ｐａｘ；ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｐｒｅ—ｃｏｌｕｍｎ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ；ＨＰＬＣ　

柱前衍生高效液相色谱法测定面制品中溴酸盐的含量

柱前衍生高效液相色谱法测定面制品中溴酸盐的含量

2017年第6期现代面粉工业文献导读

柱前衍生高效液相色谱法测定

面制品中溴酸盐的含量

针对目前离子色谱电导法检测面制品中溴酸盐

的假阳性问题，建立柱前衍生高效液相色谱测定面

制品中的溴酸盐的方法。面制品经超纯水提取、过

滤、衍生，采用C18色谱柱，紫外检测器检测。结果表

明，采用亚铁氰化钾-乙酸锌作为沉淀剂，待测液在

45 #时衍生60 min，溴酸盐浓度在0.025~1 mg/L范

围内与峰面积呈现良好线性关系，方法的加标回收

率为87.90 %~94.80 7,检出限为0.3 mg/kg，定量限

为1 mg/kg。与离子色谱法相，方法 ，

度高， 点，可很好地满足面制品中溴

酸盐的检测和控 。（文/陶涛等摘自《食品

工业科技》2017年第20期）

磨粉机磨辊磨损程度

的检测技术研究

的关 ， 与 ，

， 对面 的 和 的 作

， 对 度 检测。 对的 ， 现 的 检测 ，对

的在线检测 ， 为生 过 中

时机的确定提 的 •

和方法。（文/贾华坡等摘自《粮食加工》2017年

第5期）

基于互联网的面粉厂

能源管理系统设计与实现

针对面 加 的 ， 结 面 现

的 和生 ， 和 现 面

系。系 时测、提前、合

用为 ，用 化控制、 、通

和电子等高 ，采用目前 的B/S

， 采、 时控、

、 表 、 ，经过在面

用，现 与 化

的目标，提高了经济效益。（文/王伟生等摘

自《粮食加工》2017年第5期）预醒发冷冻面团馒头

工艺参数优化研究

在择适面的 上，究冷冻时间、

温度和解冻时间对醒发冷冻面团馒头品感官

评和硬度的 ， 面 和回归 显示：

冷冻时间和解冻时间对馒头感官评分的 显著，冷冻温度对其 极其显著;冷冻时间、冷冻温度

和解冻时间对馒头硬度的 均显著；冷冻时间与冷冻温度、冷冻时间与解冻时间之间的交互作用

不显著，冷冻温度与解冻时间之间交互作用显著。面化醒发冷冻面团馒头 化为:冷冻时间30 min，冷冻温度-35#，解冻时间60 min。

柱前衍生反相高效液相色谱法测定贝类中氨基酸含量_李娜

柱前衍生反相高效液相色谱法测定贝类中氨基酸含量_李娜

400李娜，

锁然，

许成保，

黄毅

（

河北农业大学食品科技学院，

河北保定071001）

摘要：

建立了贝类中18

种氨基酸的柱前衍生反相高效液相色谱分析法。

以2，4－

二硝基氯苯作为柱前衍生剂，

流动

相为醋酸盐缓冲溶液和乙腈，

梯度洗脱。

采用C

18柱分离，

紫外检测器检测。

对氨基酸衍生条件和水解条件进行了优

化。18

种氨基酸的工作曲线的相关系数范围为0.9915～0.9991；

相对标准偏差在0.9%～4.6%

之间；

检出限为

0.24～2.37

μg/mL；

加标回收率88.6%～115.7%。

结果表明本方法无干扰，

操作方便，

灵敏度较高，

可用于贝类中氨基酸

的含量检测。

关键词：

氨基酸，

高效液相色谱，2，4－

二硝基氯苯，

柱前衍生，

贝类

Determinationofaminoacidsinshellfishby

reversedphasehighperformanceliquidchromatography

LINa，SUORan，XUCheng－bao，HUANGYi

（CollegeofFoodScienceandTechnology，AgricultureUniversityofHebei，Baoding071001，China）

Abstract：Amethodforthedeterminationof18kindsofaminoacidsinshellfishwasdevelopedbypre－column

derivatizationhighperformanceliquidchromatography.Aderivationreagentof2，4－dinitrochlorobenzenwasused

forsamplederivatization.Theconditionsforthederivationandhydrolyzationofaminoacidswere

optimized.Detectionconditionswereasfollows：mobilephase－acetatebufferandacetonitrileingradientelution，

柱前衍生-反相高效液相色谱法测定阿胶补血口服液中主要氨基酸的含量

柱前衍生-反相高效液相色谱法测定阿胶补血口服液中主要氨基酸的含量

http://XBYZ．cbpt．cnki．net柱前衍生Ｇ反相高效液相色谱法测定阿胶补血口服液中主要氨基酸的含量汪明志,张华锋,周　坚,顾炳仁(苏州市药品检验检测研究中心,苏州　２１５１０４)摘要:目的　建立柱前衍生Ｇ反相高效液相色谱法同时测定阿胶补血口服液中主要氨基酸的含量.方法　该方法以异硫氰酸苯酯为衍生剂,以PhenomenexGeminiC１８１１０Å(２５０mm×４．６mm,５μm)为色谱柱;以乙腈Ｇ水(４∶１)为流动相A,以乙腈Ｇ０．１mol􀅰L－１乙酸钠溶液(用乙酸调节pH值为６．５)(７∶９３)为流动相B,进行梯度洗脱;柱温为４３℃;流速为１mL􀅰min－１;检测波长为２５４nm.结果　LＧ羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和LＧ脯氨酸分别在０．１２~０．７２,０．２１~１．２６,０．１６~０．９６和０．１１~０．６６μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,r值均为０．９９９９;平均回收率分别为９９．４７％,９８．５１％,９８．９１％和９８．８４％;RSD值分别为１􀆰６％,１．４％,１．６％和１．４％(n＝９).结论　该方法快速灵敏,重复性好,可作为阿胶补血口服液中主要氨基酸的含量测定方法.关键词:阿胶补血口服液;柱前衍生;反相高效液相色谱法;氨基酸DOI:１０．３９６９/j．issn．１００４Ｇ２４０７．２０２０．０１．０１０中图分类号:R９２７．２ 文献标志码:A 文章编号:１００４Ｇ２４０７(２０２０)０１Ｇ００４２Ｇ０４DeterminationofmainaminoacidsinEjiaoBuxueOralLiquidbypreＧcolumnderiＧvatizationRPＧHPLCWANGMingzhi,ZHANGHuafeng,ZHOUJian,GUBingren(SuzhouInstituteforDrugControl,Suzhou２１５１０４,China)Abstract:ObjectiveToestablishapreＧcolumnderivationRPＧHPLCmethodforthesimultaneouscontentdeterminationofmainamionacidsinEjiaoBuxueOralLiquid．MethodsPhenylisothiocyanateasderivativewasused,andthecolumnwasPhenomenexGeminiC１８１１０Å(２５０mm×４．６mm,５μm)withacetonitrileＧwater(４∶１)asmobilephaseA,acetonitrileＧ０．１mol􀅰L－１sodiumacetatesolution(adjustedbyaceticacidtopH６．５)(７∶９３)asmobilephaseB,usingradientelutionwith１mL􀅰min－１,andthetemperaturewas４３℃;thedetectionwavelengthwas２５４nm．ResultsLＧhydroxyproline,glycine,alanineandLＧprolineshowedgoodlinearrelationＧshipswiththepeakareawithintherangesof０．１２Ｇ０．７２,０．２１Ｇ１．２６,０．１６Ｇ０．９６,０．１１Ｇ０．６６μg(r＝０．９９９９);theaveragerecoverieswere９９．４７％,９８．５１％,９８．９１％and９８．８４％,RSDswere１．６％,１．４％,１．６％and１．４％(n＝９),respectively．ConclusionThismethodisrapid,sensitiveandreproducible,andcanbeusedforthedeterminationofmainaminoacidsinEjiaoBuxueOralLiquid．Keywords:EjiaoBuxueOralLiquid;preＧcolumnderivation;RPＧHPLC;aminoacid