苏云金芽孢杆菌的鉴定

现代食品XIANDAISHIPIN129/分析检测󰀡Analysis󰀡and󰀡Testing苏云金芽孢杆菌的鉴定Identification󰀡of󰀡Bacillus Thuringiensis◎ 梁梅娟，苏佩冰，殷　欢，陈靖欣（中山市食品药品检验所，广东　中山　528437）Liang Meijuan, Su Peibing, Yin　Huan, Chen Jingxin(Zhongshan Inspection Institute of Food and Drug Control, Zhongshan　528437, China)摘　要：为了探索苏云金芽孢杆菌的鉴定方法，可利用传统的生化试验结合全自动生化分析仪和基因指纹分析系统来检测，并简单分析每种方法的优劣性。传统的生化试验耗时比较长，利用VITECK-2-compact或者Ribo Printer系统进行鉴定，耗时较短，需要补充革兰氏染色镜检和蛋白毒素结晶试验才可以鉴定。关键词：苏云金芽孢杆菌；鉴定；生化反应；基因指纹分析Abstract：To explore the identification method of Bacillus thuringiensis, traditional biochemical test combined with automatic biochemical analyzer and genetic fingerprint analysis system were used for detection, and the advantages and disadvantages of the two methods were simply analyzed. Traditional biochemical tests take a long time to identify, using viteck-2-compact or RP system, which takes a short time.Gram staining experiment and protein crystallization experiment are needed to confirm Bacillus thuringiensis.Key words：Bacillus thuringiensis; Identification; Biochemical reaction; Gene fingerprint analysis中图分类号：S476.1苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）被发现已有100年的历史，其在害虫防治中发挥了巨大的作用，是近年来研究最深入、开发最迅速、应用最广泛的微生物杀虫剂。Bt的防虫原理是其菌株可产生内毒素（伴孢晶体）和外毒素两类毒素，使害虫停止取食，害虫均因饥饿、细胞壁破裂、血液败坏和神经中毒而死。近年来，国内外学者对苏云金杆菌的菌种资料、分类鉴定、伴孢晶体结构、血清学特征等方面均进行了广泛而深入的研究[1]。Bt与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，Bc）同属于蜡状芽孢杆菌菌群，为自然界中广泛分布的革兰阳性菌[2]。Bt与Bc在DNA水平上具有较高的同源性，只有个别碱基有差异，此外，Bt与Bc还有相似的生化特征，区别在于Bt能产生伴孢晶体[3]。目前，对于Bt的鉴定一般运用传统的生化试验来进行，耗时较长，试验结果不稳定且不易与Bc区分。基因指纹分析 （Ribo Printer，RP）系统是杜邦公司研发的一种全自动细菌鉴别系统，该系统建立在对核糖体DNA序列多态性分析之上[4]，可以全自动完成细菌鉴定的一系列实验。本文参考GB 4789.14-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》[5]，运用传统的生化试验结合VITECK-2-compact及RP系统对Bt进行鉴定。ｄｏｉ：１０．１６７３６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｎ４１－１４３４／ｔｓ．２０１８．２０．０４０

现代食品XIANDAISHIPIN130/分析检测Analysis and Testing1　材料与方法1.1　实验材料（1）菌株。Bt（ATCC 10792）、Bc[CMCC（B）63303]、蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides，Bm）（ATCC 10206）。（2）培养基。营养琼脂（NA）培养基、酪蛋白琼脂培养基、硫酸锰营养琼脂培养基。（3）试剂。陆桥蜡样芽胞杆菌生化鉴定盒、革兰氏阳性细菌鉴定卡BCL卡、RiboPrinter鉴定试剂盒及配套试剂（裂解液：苯酚：氯仿：异戊醇 =25∶24∶1）。（4）仪器。VITECK-2-compact全自动细菌鉴定仪、RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统。1.2　方法1.2.1　菌种的活化将菌株划线接种于营养琼脂平板，（30±1）℃培养（24±2）h。1.2.2　菌种的鉴定（1）镜检.挑取NA平板上的单个菌落，涂片，革兰氏染色后镜检。（2）生化特征反应。过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、溶菌酶耐性试验、葡萄糖利用（厌氧）、V-P试验、甘露醇试验、明胶试验以及西蒙氏柠檬酸盐试验均来自陆桥蜡样芽孢鉴定试剂盒，操作步骤参照试剂盒说明书进行。（3）酪蛋白分解和溶血试验。挑取单菌落分别接种于酪蛋白琼脂培养基和TSSB琼脂平板上， （30±1）℃培养（24±2）h，观察菌落性状。（4）根状生长试验。挑取单个菌落按间隔2～3 cm的距离划平行直线于营养琼脂平板上，（30±1）℃培养（24±2）h，观察生长情况。（5）蛋白质毒素结晶试验方法。参照GB 4789.14-2003进行。结晶试验过程中的注意事项：培养完的菌株需室温放置3 d以上，挑取少许培养物均匀涂在玻片上形成薄膜；在染色过程中，滴上碱性复红后放在火焰上加热的时候，需要注意不能让染色液沸腾或 者烧干，适当的时候需要添加染液；最后要把玻片冲洗干净。（6）VITECK-2-compact。使用BCL鉴定卡进行鉴定，时间为14.25 h，具体步骤按照操作规程以及BCL 鉴定卡说明书和相关文献资料进行[6-7]。（7）RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统。在1.5 mL PCR管中加入40 μL缓冲溶液，用取样棒挑取待测菌株的单菌落2～3个，混合均匀，95 ℃加热25 min，加入5 μL裂解液，放置于样品孔中并运行程序，选用EcoRⅠ酶切系统。将上机得出的杂交图谱与Dupont ID数据库比对，得到菌株信息。2　结果与分析2.1　形态分析Bt在NA上菌落为圆形或者椭圆形，淡黄色，边缘不规则，不透明微隆起呈滴蜡状。Bc在NA上的形态为淡黄色，不透明，边缘不规则，呈滴蜡状或毛玻璃状。Bm为白色菌落，边缘不规则，菌落表面有绒毛生长。Bt菌体在显微镜下呈紫色椭圆形杆状，大小为 （1.2～1.8）μm×（3.0～5.0）μm，呈短链或者长链状排列，芽孢为椭圆形，靠近中间生长，芽孢囊微膨大。Bc菌体在显微镜下呈紫色椭圆形杆状，大小为（1.0～1.3）μm×（3.0～5.0）μm，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或者两端，不会膨大于菌体，多呈短链或者长链状排列。Bm菌体在显微镜下呈长杆状，两端为圆形，呈链状排列，芽孢为椭圆形，靠近中生。所观察到形态现象都符合伯杰细菌手册所记录的形态特征。根据形态，可将Bm区分出来，但Bt和Bc两者的形态很接近，很难区分。2.2　生理生化试验对菌株进行了12项生化试验，结果见表1。Bt的多数生化特征与Bc、Bm都是相同的：过氧化氢酶阳性，硝酸盐还原阳性，溶菌酶耐性阳性，V-P反应阳性，葡萄糖发酵都产酸，对甘露醇都不发酵酸，动力试验都没有扩散生长，明胶试验阳性。生化特征显著不同的是：Bt和Bc都分解酪蛋白，Bm不分解酪蛋白；溶血试验：Bt和Bc都有明显的溶血环，而Bm只是呈现很弱的溶血现象；Bt和Bc呈粗糙山谷状生长，Bm

现代食品XIANDAISHIPIN131/分析检测󰀡Analysis󰀡and󰀡Testing呈根状生长特征；西蒙氏柠檬酸盐试验只有Bc是阳性。表1　Bt与其他芽孢杆菌生化特征的区别表项目BtBcBm过氧化氢酶+++动力---硝酸盐还原+++溶菌酶耐性+++葡萄糖利用（厌氧）+++V-P试验+++甘露醇产酸---酪蛋白分解++-溶血试验+++根状生长明胶西蒙氏柠檬酸盐-+--++++-注：+表示阳性，-表示阴性。2.3　蛋白质毒素结晶试验伴孢晶体的形成是Bt的重要生化特征，也是其在微生物分类时的重要依据[8]。在显微镜下明显能观察到Bt有游离芽孢和深红色的菱形蛋白晶体，见图1，而Bc和Bm只观察到游离芽孢。图1　Bt的伴孢晶体染色图2.4　VITECK-2-compact鉴定结果VITECK-2-compact是应用经典的生化反应进行细菌鉴定的全自动仪器。Bt、Bc和Bm经BCL TEST KIT VITEK 2鉴定，鉴定结果都是显示Bacillus cereus /thuringiensis/mycoides。结果分析表明，VITECK-2-compact所运用的生化反应不能把这3种芽孢杆菌单独鉴定出来，要确定待测菌株是否为Bt，需要补充蛋白质结晶试验，详细分析见表2。表2　VITECK-2-compact鉴定结果分析表分析微生物并进行分离试验结果Bc根状试验（0），蛋白毒素结晶试验（0）Bt根状试验（0），蛋白毒素结晶试验（100）Bm根状试验（100），蛋白毒素结晶试验（0）注：0表示阴性，100表示阳性。2.5　RP系统对待测菌株的鉴定结果待测菌株ATCC10792、CMCC（B）63303和ATCC 10206经过RP系统分析都出现了清晰的DNA指纹图谱。结果表明，数据库中与待测菌株ATCC 10792、CMCC（B）63303和ATCC 10206与Dupont相似度较高的菌株分别为Bt、Bc和Bm，相识度均达到 90%以上。用RP系统对Bt的鉴定，避免了其他因素的干扰，用时较短，8 h就可以得出结果。表3就是经过RP系统对Bt分析出来的结果，从表3中可以看出，第6组是待测菌株ATCC 10792的基因指纹图谱，第1～5组是待测菌株与数据库中基因指纹图谱相识度较高的基因条带。从图中第3组和第4组可知，Bt与Bc的基因条带的相识度比较高。不过从表3的结果分析图上可以得出运用RP系统鉴定Bt，还需要结合其生化反应才能确认最终结果。

现代食品XIANDAISHIPIN132/分析检测Analysis and Testing

3　结论无论是运用全自动细菌鉴定分析仪还是RP系统鉴定Bt，最终都需要结合革兰氏染色镜检和蛋白毒素结晶试验，才能确定待测菌株为Bt。如果三者皆符合，则确认该菌株为Bt，如果其中之一不符合，则被否定。因为无论是运用RP系统和全自动生化分析仪对Bt进行鉴定，最终得出的结果都是需要结合其特征生化反应来确认结果。通过革兰氏染色镜检进一步确认菌株的形态，蛋白毒素结晶试验是Bt的生化特征反应，因此需要结合这两项试验才能确认最终结果。全自动生化分析仪所用实验时间长一些，并且不能把苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌分出来。RP系统与全自动生化鉴定仪鉴定比较，RP系统用时较短且准确性较高，但成本也较高，试剂耗材较贵，每次要运行8个样品，而且制备样品条时纯培养物的取样量要掌握好，才能出现比较好的DNA指纹图谱。Bt对于农作物防治害虫有重大的作用，随着科学技术水平的提高和对Bt研究的深入，新的鉴定方法会不断涌现，基因分析鉴定方法也会更完善，普及范围更广，检测成本更低，有利于提高鉴定效率，推动杀虫剂相关产业的发展。采用基因工程技术筛选、分离Bt菌株应该是将来的对于Bt鉴定的主要研究方向[9]，本研究结果也为这项技术提供一定的理论依据。此外，伴孢晶体形成是Bt的重要特征，在RP系统的基础上进行蛋白毒素结晶试验，有利于提高鉴定效率。参考文献：[1]彭中允.苏云金杆菌的开发和利用[M].北京：北京农业出版社，1987.[2]Rasko DA，Altherr MR，Han CS，et al.Genomics of the bacillus cereus group of organisms[J].FEMS Microbiol Rev，2005，29（2）：303-329.[3]Giffel MCT，Beumer RR，Klijn N，et al.Discrimination between Bacillus cereus and Bacillus Thuringiensis using specific DNA probes based on variable regions of 16S rRNA[J].FEMS Microbiol Lett，2010，146（1）：47-51.[4]夏明星，赵文军，马 青，等.植物病原细菌DNA分子检测技术[J].植物检疫，2005，19（1）：39-42.[5]国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.14-2014 食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验[S].北京：中国标准出版社，2015.[6]Bosy-Westphal A，Ruschmeyer M，Czech N，et al.Determinants of hyperhomocysteinemia in patients with chronic liver disease and after orthotopic liver transplantation[J].Am J Clin Nutr，2003，77（5）：1269-1277.[7]Pera-Kaján J，Jakubowski H.Paraoxonase 1 and homocysteine metabolism[J].Amino Acids，2012，43（4）：1405-1417.[8]何献君，宗　浩，郑　鸽，等.一株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)的分离与鉴定[J].四川师范大学学报（自然科学版），2002，25（3）：301-303.[9]李达娜，钱　龙.苏云金芽孢杆菌的分离及快速鉴定[J].贵州农业科学，2002，30（4）：34-35.作者简介：梁梅娟（1988—），女，助理工程师，食品检验员；专业方向为食品检测。表3　Bt的鉴定结果分析表（基因指纹图谱）类型编号相识度鉴定结果DNA指纹图谱1杜邦IDDUP-60310.93Bt(需结合生化反应)2杜邦IDDUP-212400.92Bt(需结合生化反应)3杜邦IDDUP-125610.88Bc(需结合生化反应)4杜邦IDDUP-132090.85Bc(需结合生化反应)5杜邦IDDUP-132060.84Bc6样品组ECOR1 704-10-S-41.00