单增李斯特氏菌2

1mL
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个 种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、 英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。

本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
— 7—
三、标准检测流程
1 增菌
分离
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
2
— 8—
3 初筛 鉴定 4
5 结果与报告
综合生化试验和溶血试验结 果，报告 25 g（mL）样品 中检出或未检出单核细胞增 生李斯特氏菌。
A. 单增李斯特氏菌，在靠近
金黄色葡萄球菌接种端 溶血增强。 B. 斯氏李斯特氏菌溶血也 增强。
C. 伊氏李斯特氏菌在靠近马 红球菌接种端溶血增强。
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
— 21 —
单增李斯特菌 斯氏李斯特氏菌 伊氏李斯特氏菌
马红球菌
金葡
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
— 22 —
空白对照
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
— 13 —
三、检测标准流程
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
局部放大的菌落
— 14 —
三、检测标准流程
显色培养基：
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
— 15 —
三、检测标准流程
③初筛：
木糖、鼠李糖发酵管
TSA-YE 平板划线纯化
选择性琼脂平板
干制生化鉴定试剂盒 单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
半固体动力培养
— 30 —
1、简述单增李斯特氏菌的检 测基本步骤？
2、简述增菌液的配制过程。
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
— 31 —
智慧职教 /portal/
校本资源库 / 参考网站： /
三、检测标准流程
①增菌培养： 无菌取样品25g(mL)放入灭菌均质杯或均质袋中加225mL

单增李斯特氏菌
单核细胞增生李斯特菌 (L.monocytohenes)
潜伏期：在感染后3-70天出现症状，健康成人可出现轻微类似流感症状，易感者突然发热，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产。

在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2分钟以上。

李斯特氏菌。

该细菌喜冷不爱热，如果人被感染，将有三成的病死率。

李斯特氏菌。

此菌的特性是喜冷怕热，在低温环境中可大量繁殖。

人们习惯于把电冰箱当作食品的保险箱，将一次吃不完的食物随手放进冷藏室，未经加热消毒就食用，这是李斯特氏菌的一种重要传播途径。

人感染该菌后多表现为脑膜炎、败血症，孕妇感染则可引起流产、早产、死胎和新生儿败血症。

在夏季每个家庭都要格外注意饮食卫生，电冰箱要定期清洗，存放的食物要生熟分开，熟食在食用前要加热消毒，温度必须达到70℃以上且持续2分钟以上。

健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，
4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。

人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。

面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
养。细菌在 30-­‐35℃培养箱中培养 24-­‐48h，真菌在 23-­‐28℃培养箱中培养 24-­‐72h
储存温度：-­‐80℃
基 因 组 ：
单增李斯特菌
简 介 ：
斯特菌（学名：Listeria monocytogenes），又名单核球增多性李斯特
菌、李氏菌，是一种兼性厌氧细菌，为李斯特菌症的病原体。李斯特菌是
革兰氏阳性菌，属厚壁菌门。它主要以食物为传染媒介，是最致命的食源
性 病 原 体 之 一 。
操 作 说 明 ：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
单增李斯特菌
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00470
单增李斯特菌

C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数：
1.1—计算系数；
d一稀释因子（第一稀释度）。
结果报告（根据公式计算结果,报告每g（m1）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU∕g（m1）表示；如T值为0,则以小于I乘以最低稀释倍数报告。）
报告人报告日期复核人复核日期
培养基及试剂：
缓冲葡萄糖蛋白陈水：m1配制日期：
李氏增菌肉汤1B：m1配制日期：
李斯特氏菌显色培养基：m1配制日期：
实验过程：
1.样品稀释：
根据样品状态，无菌操作，称取25g∕吸取25m1样品，加入到装有225m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌均质袋中均质，制成1:10样品匀液。
用Im1无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液Im1,沿管壁缓慢注于盛有9m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支In1I无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
3.培养
在通常情况下，涂布后，将平板静置10min,如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36C±IC培养Ih;等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36℃±IC培养24-48hJ_/__/时〜_/_/时）
典型菌落计数和确认：注：“一”表示在选择性平板中无可疑菌落生长。
样品编号
菌落特征以产品说明为准
第一稀释度：
d）所有稀释度的平板菌落数大于150CFU且有」
e）所有稀释度的平板菌落数均不在15CFU~150CF时，应计数最接近15CFU或150CFU的稀释度平标
收，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15CFU~150CFU
）CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；

单增李斯特氏菌说明书安全操作及保养规程一、引言单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食品中毒病原菌，可引起人类严重的感染。

为了确保操作过程的安全性和实验结果的准确性，本文档将介绍单增李斯特氏菌的安全操作和保养规程。

二、实验前准备1.工作区域：选择干净整洁、通风良好的实验室，并确保无人员流动和非实验人员进入实验区域。

2.实验器材：准备好需要使用的培养皿、试管、移液器、离心机等实验器具，并进行消毒处理。

3.个人防护措施：穿戴实验服、手套、护目镜等个人防护装备，避免直接接触菌株。

三、操作步骤1.培养基准备：根据实验需求，制备适当培养基，并严格按照配方进行配置、混合和消毒。

2.菌株接种：取一支保存有单增李斯特氏菌的细菌种子液，并使用无菌的移液器将其接种到培养基中。

3.培养条件：将接种好的培养基置于恒温培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养。

根据具体需要，可以选择不同的培养条件。

4.培养时间：根据菌株的生长特性和实验目的，设定适当的培养时间。

在培养过程中，定期观察培养基的变化情况。

四、实验后处理1.菌株保存：实验结束后，将培养好的菌株进行分装并保存。

使用无菌的容器和保护液，防止菌株失活或变异。

2.器材清洗：实验器材需要彻底清洗，以防止交叉污染。

使用适当的消毒剂和清洁剂，对实验教具进行彻底清洁和消毒处理。

3.工作区清理：清理工作区域，包括实验台面、废弃物和其他杂物的清理。

确保实验室的环境整洁，以减少潜在的污染风险。

五、安全注意事项1.个人防护：在实验操作过程中，要正确佩戴实验服、手套、护目镜等个人防护装备，避免直接接触菌株。

2.实验环境：选择合适的实验环境，保持实验室的通风良好，并避免非实验人员进入实验区域。

3.消毒处理：在实验前后对实验器材、工作区域进行彻底的消毒处理，以减少交叉污染的风险。

4.废弃物处理：将实验中产生的废弃物，如培养基、菌株等，正确处理和清理，并根据实验室的要求进行垃圾分类处理。

市场情况
1999年底，美国发生了历史上因食用带有李斯特菌的食 品而引发的最严重的食物中毒事件，据美国疾病控制和防 治中心资料显示，在美国密歇根州有14人因食用被该菌污 染的“热狗”和熟肉而死亡，在另外22个州97人患此病，6 名妇女流产。1992～1995年法国出产的奶酪及猪肉中发现 李斯特菌。2001—2009年以来，我国质检部门多次从美国、 加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等20多家肉类加工 厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等30多批近千吨猪副产 品中检出单增李斯特菌、沙门氏菌等致病菌。为了解北京 市食品受单核细胞增生性李斯特菌污染状况，2004—2005 年间，崔京辉等从北京市几个市场及宾馆饭店共采集了270 份熟食、生肉制品、水产品等8类食品进行检测LM。
（4） PCR试剂盒
1）北京吉诺思科贸公司：美国伯乐iQ-Check单增李斯特 菌的检测：iQ-Check系统采用了所有的实时荧光PCR方法 的优点为食品中病原微生物提供快速和可靠地检测解决方 案。iQ-Check试剂盒为食品和环境样品中的单增李斯特菌 (Listeria monocytogenes)定性检测试剂盒。 2）陆桥： 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）荧 光定量PCR检测试剂盒 报价：1680 48T 3）索奥： 单增李斯特菌(LM)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 报价：2800 40T

在美国LM被列为7种主要的食源性致死病菌之一,已经被 WHO食品安全工作计划列为重点检测的食源性病原菌之一。
二、单增李斯特菌的检测方法
（1）食品安全国家标准：单核细胞增生李斯特氏菌 检验 （2010年最新）平板培养法
2007年食品中单增李斯特菌国 家标准检验方法实验 室验证及结果分析：用不同浓度的沙门菌菌悬液人 工染菌二类食品各40份，用增菌液两步增菌，两种 分离培养基分离，对比检出率及分离效果。检出率 62．5％，最低检出限为0.5cfu/25g-13cfu/25g。

进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂 菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差
L.M在PALCAM培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上 的菌落形态
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～ 0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。
单增李斯特菌溶血反应 阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培 养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶 血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的 单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌 病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措 施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应 的标准。
形态与染色
革兰氏阳性小杆菌，长 0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈 V 字形，成对 排列。
无芽胞，一般不形成荚膜。
22~25 ℃环境中形成 4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小 鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。 试验时可用已知菌作对照。单核细胞增

食品中单增李斯特菌检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测实验目的1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。

2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。

基本原理单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。

单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。

李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。

此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。

人也可作为无症状携带者。

据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。

李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。

该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5μm ′0.5～2.0μm。

多单在，有时是V字型排列。

无芽孢，不产生荚膜。

在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20μm 或更长的丝状。

在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。

本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。

对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。

加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。

在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。

在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。

在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。

不形成菌环、菌膜。

在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。

单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌
效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。

上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸0.1mlLB1增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。

二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。

（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。

此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。

七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿
素
硝
酸
盐
还
原
VP MR H2O2
++----+++。

单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。

该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。

李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。

检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。

1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。

培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。

在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。

培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。

2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。

这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。

通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。

3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。

这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。

这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。

需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。

常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。

对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。

生物学特性 培养
需氧或微需氧菌 生长温度范围：0.5~45 ℃ 一般实验室培养基生长良好 菌落细小，斜射光观察呈现
特殊的蓝绿色
单核细胞增多性李斯特菌
生物学特性
• 该菌对理化因素抵抗力较强：在土壤、粪便、青储 饲料和干草内能长期存活
• 在培养基中放于4℃可存活3～4年 • 对碱和盐抵抗力强，10％～15％NaCl培养基中能生
对氧不稳定的细菌溶血素 LLO可能作用于心肌的收缩和起搏点 LLO是本菌的主要毒力因子，缺失LLO的菌株无毒 由hly基因编码
单核细胞增多性李斯特菌
李斯特菌溶血素O
单核细胞增多性李斯特菌
内在素
• 一种细菌表面蛋白 • 能与上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、单核—巨噬
细胞等多种真核细胞结合 • 本菌感染内皮细胞两种机制之一： ① 细菌从感染的单核—巨噬细胞通过细胞与细胞间
长，16％NaCl培养基中可存活一年，25％NaCl环境 中仍可存活 • 60-70℃经5-20min可杀死 • 70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5% 福尔马林20min 可杀死此菌
单核细胞增多性李斯特菌
单核细胞增多性李斯特菌
生物学特性
分型
• 血清型：根据O抗原和H抗原分为16个血清型
单核细胞增多性李斯特菌
致病性
单增李斯特菌进入人体是否得病与菌量和宿主的年龄 免疫状态有关
李斯特氏菌对于高危人群102个/g就可致病，而对于 健康人108个/g也可能安然无恙
易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人、免疫功能 缺陷者
单核细胞增多性李斯特菌
临床表现：
• 潜伏期：在感染后3-70天出现症状
• 血清型与症状之间无相关性

FDA食品中单增李斯特氏菌的检测与计数方法食品中单增李斯特氏菌的检测与计数李斯特有6种菌种：L.innocua , L.seeligcri , L.welshimeri , L.ivanovii , L.grayi、L.grayi和L.ivanovii含有2个亚种，这里不作明确分析。

Rocourt最新的细菌分类法代替了以前的分类法。

L.ivanovii与单增李斯特氏菌是老鼠和其他动物的致病菌，然而，只有单增李斯特氏菌是人类致病菌，L.ivanoviij与L.seeligeri在人类中很少见。

近来，我们充分讨论了食品中单增李斯特氏菌的存在性，及其传染性详细资料。

因而本篇重点介绍单增李斯特氏菌的鉴定与计数。

食品加工过程中，例如食品接触表面及加工工具的致病原检测就不作介绍了。

分离与检测单增李斯特氏菌快速有效的方法如下：以污染的食品为样品，通常据FDA实验规则，样品是混合物。

待分析的部分样品放入BLEB（奶制品放入AOAC或IDF）中，30℃培养4h，进行李斯特菌选择性增菌。

在第四个小时加入选择剂：acriflavin（10mg/L），sodium nalidixate（40mg/L），optional antifungal，cycloheximide（50mg/L）。

然后继续培养48h，在24h和48h时，将培养物划线接种于不同的选择性培养基来分离李斯特菌。

有些快速检测到李斯特菌的存在。

先在标准增菌液或呈现阳性的增菌液中进行李斯特菌增菌，之后划线到选择培养基上进行纯化，然后在非选择培养基上纯化，最后通过常规检测实验或一系列生化实验来确定是否为单增李斯特氏菌。

利用具体实验，分离物会快速地被鉴定是否为单增李斯特氏菌。

FDA规则中，必须依照血清类型`PFGE及核糖类型分类。

利用选择性培养基的菌落计数及MPN计数法可以对单李进行计数。

（MPN计数法是先用BLEB选择性增菌，再涂布于ALOA或BCM选择性培养基上）主要内容如下：1．增菌液及快速检测实验是可以选择的2．可用任一种选择分离培养基（OXA 、PALLCAM 、添加七叶苷和三价铁的LPM 、MOX）来代替两种选择性培养基。

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

鉴定
血清学检验 菌悬液于80℃水域中加热1h，离心弃上清， 剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清 学玻片凝集试验。
单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B， 1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C， 4D，4E，7
质量控制
每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株 进行质量控制。 样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中 加入新鲜配制的每毫升含有10个～100个单 核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性 培养物，按检验程序进行同步检验。
报告结果
协同溶血试验、血清学试验可根据需要进 行，常规检验可不进行这些试验。
报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特 氏菌。
报告阴性结果：未检出单核细胞增生李斯 特氏菌。
新旧标准的主要不同
增菌培养基 EB Fraser 选择性培养基MMA OXA和PALCAM 生化试验和协同溶血试验 API鉴定 增加VIDAS快速筛选 取消小鼠毒力试验
鉴定
溶血试验
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核
细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性
对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h～ 48h。
单核细胞增生李斯特氏菌 窄小的β溶血环
西尔李斯特氏菌
窄小的β溶血环
绵羊李斯特氏菌
大的β溶血环
其他
不溶血
鉴定
动力试验 穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋/ 产酸， ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ 不产H2S
＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － － ＋/ 产酸， ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ 不产H2S
鉴定
协同溶血试验 （cAMP）
在羊血琼脂平板上各

食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验1范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(L i s t e r i am o n o c y t o g e n e s)的检验方法㊂本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低(<100C F U/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数,特别是牛奶㊁水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:2ħ~5ħ㊂2.2恒温培养箱:30ħʃ1ħ㊁36ħʃ1ħ㊂2.3均质器㊂2.4显微镜:10x~100x㊂2.5电子天平:感量0.1g㊂2.6锥形瓶:100m L㊁500m L㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌平皿:直径90mm㊂2.9无菌试管:16mmˑ160mm㊂2.10离心管:30mmˑ100mm㊂2.11无菌注射器:1m L㊂2.12单核细胞增生李斯特氏菌(L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s)A T C C19111或C M C C54004,或其他等效标准菌株㊂2.13英诺克李斯特氏菌(L i s t e r i a i n n o c u a)A T C C33090,或其他等效标准菌株㊂2.14伊氏李斯特氏菌(L i s t e r i a i v a n o v i i)A T C C19119,或其他等效标准菌株㊂2.15斯氏李斯特氏菌(L i s t e r i a s e e l i g e r i)A T C C35967,或其他等效标准菌株㊂2.16金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)A T C C25923或其他产β-溶血环金葡菌,或其他等效标准菌株㊂2.17马红球菌(R h o d o c o c c u s e q u i)A T C C6939或N C T C1621,或其他等效标准菌株㊂2.18小白鼠:I C R体重18g~22g㊂2.19全自动微生物生化鉴定系统㊂3培养基和试剂3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(T S B-Y E):见A.1㊂3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(T S A-Y E):见A.2㊂3.3李氏增菌肉汤L B(L B1,L B2):见A.3㊂3.41%盐酸吖啶黄(a c r i f l a v i n eH C l)溶液:见A.3.2.1㊁A.3.2.2㊂3.51%萘啶酮酸钠盐(n a l a d i x i c a c i d)溶液:见A.3.2.1㊁A.3.2.2㊂3.6 P A L C AM琼脂:见A.4㊂3.7革兰氏染液:见A.5㊂3.8S I M动力培养基:见A.6㊂3.9缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(M R)和V-P试验用]:见A.7㊂3.105%~8%羊血琼脂:见A.8㊂3.11糖发酵管:见A.9㊂3.12过氧化氢试剂:见A.10㊂3.13李斯特氏菌显色培养基㊂3.14生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统㊂3.15缓冲蛋白胨水:见A.11㊂第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验4检验程序单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1㊂图1单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取样品25g(m L)加入到含有225m LL B1增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n;或放入盛有225m LL B1增菌液的均质杯中,以8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h,移取0.1m L,转种于10m LL B2增菌液内,于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂5.2分离取L B2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和P A L C AM琼脂平板,于36ħʃ1ħ培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落㊂典型菌落在P A L C AM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征,参照产品说明进行判定㊂5.3初筛自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落,分别接种木糖㊁鼠李糖发酵管,于36ħʃ1ħ培养24hʃ2h,同时在T S A-Y E平板上划线,于36ħʃ1ħ培养18h~24h,然后选择木糖阴性㊁鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定㊂5.4鉴定(或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等)5.4.1染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4μm~0.5μm)ˑ(0.5μm~2.0μm);用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动㊂5.4.2动力试验:挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或S I M动力培养基,于25ħ~30ħ培养48h,李斯特氏菌有动力,在半固体或S I M培养基上方呈伞状生长,如伞状生长不明显,可继续培养5d,再观察结果㊂5.4.3生化鉴定:挑取纯培养的单个可疑菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和M R-V P试验㊂单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1㊂5.4.4溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上,每格刺种一个菌落,并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂, 36ħʃ1ħ培养24h~48h,于明亮处观察,单增李斯特氏菌呈现狭窄㊁清晰㊁明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈,英诺克李斯特氏菌无溶血圈,伊氏李斯特氏菌产生宽的㊁轮廓清晰的β-溶血区域,若结果不明显,可置4ħ冰箱24h~48h再观察㊂注:也可用划线接种法㊂5.4.5协同溶血试验c AM P(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离1mm~ 2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌㊁英诺克李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~10mm的 箭头状 β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象㊂若结果不明显,可置4ħ冰箱24h~48h再观察㊂注:5%~8%的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一端有溶血增强现象㊂表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖M R-V P甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌(L.m o n o c y t o g e n e s)++++/+-+-+格氏李斯特氏菌(L.g r a y i)-+++/++--+斯氏李斯特氏菌(L.s e e l i g e r i)++++/+--++威氏李斯特氏菌(L.w e l s h i m e r i)-+++/+-V++伊氏李斯特氏菌(L.i v a n o v i i)++++/+--++英诺克李斯特氏菌(L.i n n o c u a)-+++/+-V-+注:+阳性;-阴性;V反应不定㊂5.5小鼠毒力试验(可选项目)将符合上述特性的纯培养物接种于T S B-Y E中,于36ħʃ1ħ培养24h,4000r/m i n离心5m i n,弃上清液,用无菌生理盐水制备成浓度为1010C F U/m L的菌悬液,取此菌悬液对3只~5只小鼠进行腹腔注射,每只0.5m L,同时观察小鼠死亡情况㊂接种致病株的小鼠于2d~5d内死亡㊂试验设单增李斯特氏菌致病株和灭菌生理盐水对照组㊂单核细胞增生李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性㊂5.6结果与报告综合以上生化试验和溶血试验的结果,报告25g(m L)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌㊂第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法6检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2㊂图2单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1以无菌操作称取样品25g(m L),放入盛有225m L缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B肉汤的无菌均质袋内(或均质杯)内,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n或以8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂液体样品,振荡混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂7.1.2用1m L无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂7.1.3按7.1.2操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液㊂每递增稀释1次,换用1支1m L无菌吸管或吸头㊂7.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度的样品匀液分别吸取1m L以0.3m L㊁0.3m L㊁0.4m L的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板,用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘㊂使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在25ħ~50ħ的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失㊂7.3培养7.3.1在通常情况下,涂布后,将平板静置10m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36ħʃ1ħ培养1h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂7.4典型菌落计数和确认7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准㊂7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15C F U~150C F U之间的平板,计数典型菌落数㊂如果:a)只有一个稀释度的平板菌落数在15C F U~150C F U之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;b)所有稀释度的平板菌落数均小于15C F U且有典型菌落,应计数最低稀释度平板上的典型菌落;c ) 某一稀释度的平板菌落数大于150C F U 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;d ) 所有稀释度的平板菌落数大于150C F U 且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;e ) 所有稀释度的平板菌落数均不在15C F U~150C F U 之间且有典型菌落,其中一部分小于15C F U 或大于150C F U 时,应计数最接近15C F U 或150C F U 的稀释度平板上的典型菌落㊂以上按式(1)计算㊂f ) 2个连续稀释度的平板菌落数均在15C F U~150C F U 之间,按式(2)计算㊂7.4.3 从典型菌落中任选5个菌落(小于5个全选),分别按5.3㊁5.4进行鉴定㊂8 结果计数T =A BC d(1)式中:T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;d稀释因子㊂T =A 1B 1/C 1+A 2B 2/C 21.1d(2)式中:T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A 1第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B 1 第一稀释度(低稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C 1 第一稀释度(低稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;A 2 第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B 2 第二稀释度(高稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C 2第二稀释度(高稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;1.1 计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂9 结果报告报告每g (m L )样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数,以C F U /g(m L )表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告㊂第三法 单核细胞增生李斯特氏菌M P N 计数法10 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌M P N 计数法检验程序见图3㊂图3单核细胞增生李斯特氏菌M P N计数程序11操作步骤11.1样品的稀释按7.1进行㊂11.2接种和培养11.2.1根据对样品污染状况的估计,选取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10m LL B1肉汤,每一稀释度接种3管,每管接种1m L(如果接种量需要超过1m L,则用双料L B1增菌液)于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂每管各移取0.1m L,转种于10m LL B2增菌液内,于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂11.2.2用接种环从各管中移取1环,接种李斯特氏菌显色平板,36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂11.3确证试验自每块平板上挑取5个典型菌落(5个以下全选),按照5.3㊁5.4进行鉴定㊂12结果与报告根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数,查M P N检索表(见附录B),报告每g(m L)样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数,以M P N/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(T S B-Y E)A.1.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g蒸馏水1000m LA.1.2制法将上述各成分加热搅拌溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(T S A-Y E)A.2.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.2.2制法将上述各成分加热搅拌溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.3李氏增菌肉汤(L B1,L B2)A.3.1成分胰胨5.0g多价胨5.0g酵母膏5.0g氯化钠20.0g磷酸二氢钾1.4g磷酸氢二钠12.0g七叶苷1.0g蒸馏水1000m LA.3.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.3.2.1李氏Ⅰ液(L B1)225m L中加入:1%萘啶酮酸(用0.05m o l/L氢氧化钠溶液配制)0.5m L1%吖啶黄(用无菌蒸馏水配制)0.3m LA.3.2.2李氏Ⅱ液(L B2)200m L中加入:1%萘啶酮酸0.4m L1%吖啶黄0.5m LA.4P A L C A M琼脂A.4.1成分酵母膏8.0g葡萄糖0.5g七叶甙0.8g柠檬酸铁铵0.5g甘露醇10.0g酚红0.1g氯化锂15.0g酪蛋白胰酶消化物10.0g心胰酶消化物3.0g玉米淀粉1.0g肉胃酶消化物5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.4.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.4.2.1P A L C A M选择性添加剂多粘菌素B5.0m g盐酸吖啶黄2.5m g头孢他啶10.0m g无菌蒸馏水500m LA.4.2.2制法将P A L C AM基础培养基溶化后冷却到50ħ,加入2m LP A L C AM选择性添加剂,混匀后倾倒在无菌的平皿中,备用㊂A.5革兰氏染色液A.5.1结晶紫染色液A.5.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20.0m L1%草酸铵水溶液80.0m LA.5.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.5.2革兰氏碘液A.5.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.5.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.5.3沙黄复染液A.5.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LA.5.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.5.4染色法A.5.4.1涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液,作用1m i n,水洗㊂A.5.4.2滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂A.5.4.3滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A.5.4.4滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A.6S I M动力培养基A.6.1成分胰胨20.0g多价胨6.0gG B 4789.30 201611 硫酸铁铵0.2g 硫代硫酸钠0.2g 琼脂3.5g 蒸馏水1000m L A .6.2 制法将上述各成分加热混匀,调节p H 至7.2ʃ0.2,分装小试管,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A .6.3 试验方法挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到S I M 培养基中,于25ħ~30ħ培养48h ,观察结果㊂A .7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(M R 和V P 试验用)A .7.1 成分多价胨7.0g 葡萄糖5.0g 磷酸氢二钾5.0g 蒸馏水1000m L A .7.2 制法溶化后调节p H 至7.0ʃ0.2,分装试管,每管1m L ,121ħ高压灭菌15m i n ,备用㊂A .7.3 甲基红(M R )试验A .7.3.1 甲基红试剂A .7.3.1.1 成分甲基红10m g 95%乙醇30m L 蒸馏水20m LA .7.3.1.2 制法10m g 甲基红溶于30m L95%乙醇中,然后加入20m L 蒸馏水㊂A .7.3.1.3 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36ħʃ1ħ培养2d ~5d ㊂滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果㊂鲜红色为阳性,黄色为阴性㊂A .7.4 V -P 试验A .7.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液成分及制法:取α-萘酚6.0g ,加无水乙醇溶解,定容至100m L ㊂。

单增李斯特氏菌及其检测方式一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。

其中，单增李斯特菌是唯一能引发疾病的人畜共患病的。

它能引发人、畜的李氏特菌病，感染后要紧表现为、和单核细胞增多。

二、单增李斯特氏菌检测方式1.细菌培育法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在一般冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。

LM在一般琼脂平板上呈细小直径约、半透明露珠样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培育基上呈蓝绿色。

2.生化鉴定法该菌要紧生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红实验和精氨酸水解实验阳性；⑨对碱和盐抗击力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、%石碳酸、%氢氧化钠、%福尔马林20min可杀死此菌。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均灵敏。

3.血清凝集法依照菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、五、6a、6b、7。