pCS2 质粒序列

（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

整理慢病毒稳转细胞株步骤竹密岂妨流水过蛮鬼2021. 3山高哪碍野云飞稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80°C保存2-3 年，质粒-20°C保存2-3年，病毒液-80°C保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号屮以及抗性或荧光基因、gag基因5’端350bp的序列及位丁,nv序列中的RRE,含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）:包含了 pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了 env基因.三种质粒共同转染产生不具有口我复制能力的病毒载体。

2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE （-20°C保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4°C保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8. 766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高圧蒸汽灭菌**也可直接从公司买來病毒液（-80°C封口膜封口冻存管保存，4°C保存3夭）：滴度一般为 108TU/ml6x 10mg/ml polybrene （-20°C分装保存）:漠化己二甲鞍。

是带正电的小分子,与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2〜10倍。

有一定细胞毒性，需要摸索浓度（l-10Ug/ml） 7、无血清培养基： optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：卩票吟霉索,用于筛选稳转细胞二、具体步骤病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10X105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml,过夜2、配制5XPEG8000/NaCl 溶液称取 NaCl 8. 766 g; PEG8000 50g 溶解在 200ml Milli-Q 纯水中；121 摄氏度 30min 湿热灭绝30min：保存在4°C第二夭1、配管 A 管试剂 PLKO. 1/pCDH psPAX2 pMD2. G Opti B 管 XTREME-GENE Opti 加样＞/ul 推荐量/ul、Pg合计3 1 2 200 6 200 206 206 A+B混合室温静置20min 2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2,孵育10h,换成5ml全培养基1/5 （稳转）竹密岂妨流水过蛮鬼2021. 3山高哪碍野云飞第四天第五夭：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml （-80°C保存）2、过滤：用孔径为0. 45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液,每 30min-lh上下摇匀一次4、4°C过夜第六夭1、4°C, 3500rpm» 20min2、弃上清，倒扣纸上静置l-2min,吸干残余液体3、加入120-150 P 1 PBS,缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50U1分装，-80°C保存。

长喙田菁植物螯合肽合成酶PCS2的原核表达及纯化李安明;邓青云;李德华【摘要】为了获得纯化的长喙田菁(Sesbania rostrata)植物螯合肽合成酶PCS2,以原核表达载体pMAL-c2x为基础,构建了含有SrPCS2开放阅读框序列的原核表达载体pAM57,将其转化表达菌株BL21 (DE3),对融合蛋白的表达进行了优化,通过Western blotting鉴定融合蛋白,并用麦芽糖亲和柱对MBP-SrPCS2融合蛋白进行纯化.结果表明:在15℃下,经0.2 mmol/L IPTG诱导16h可以表达出可溶性的MBP-SrPCS2融合蛋白,通过亲和层析得到了纯化的MBP-SrPCS2融合蛋白,为进一步研究SrPCS2的活性及PCS的催化机制奠定了基础.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2011(046)006【总页数】5页(P150-154)【关键词】植物螯肽合成酶;SrPCS2;原核表达;纯化【作者】李安明;邓青云;李德华【作者单位】孝感学院生命科学技术学院,湖北孝感432000;孝感学院生命科学技术学院,湖北孝感432000;孝感学院生命科学技术学院,湖北孝感432000【正文语种】中文【中图分类】Q786植物螯合肽（phytochelatin，PC）是一类由植物螯合肽合成酶（PCS）催化合成的小肽，具有（γ－Glu－Cys）n－Gly的结构，其中n＝2～11［1］，它们可以提高植物对重金属的抗性，以解除重金属对植物的毒害作用，维持细胞内环境中金属离子浓度的相对稳定［2］.自1989年第1次部分分离纯化得到PCS以来［3］，就开始对PCS的催化机制包括其被金属离子的激活过程的研究，但得到的研究结果不尽相同.Cobbett［4］提出保守的 N－末端具有催化活性，酶的激活来自于金属离子与该结构域，可能是半胱氨酸的相互作用，C末端结构域是PCS的重金属传感器，由于该结构域也有很多半胱氨酸，它们首先结合Cd2＋，然后去激活N末端结构域.随后研究人员又克隆到 PCS 基因［5－7］，加速了 PCS催化机制的研究.Vivares等［8］用原核生物蓝细菌的PCS（NsPC）建立了乙酰化条件下的立体结构，同时建立了PCS属于木瓜蛋白酶超家族和其催化机制与半胱氨酸蛋白酶相似的模型；通过比较，他们提出NsPC的Cys70、His183及 Asp201分别对应于 AtPCS1的Cys56、His162与Asp180组成1个类似于木瓜蛋白酶的三联体的催化结构域，突变体的研究表明其中的任何1个对AtPCS1的催化活性都是必不可少的［9］.已有通过原核生物表达PCS基因，研究其催化机制的报导［9－10］.与真核表达系统相比，原核表达系统操作简便，技术成熟，可以在短时间内得到大量重组蛋白.但是在原核生物中表达真核生物蛋白，常常形成包涵体，需要进行复性，但是蛋白质复性工作比较困难，失败的风险较大.作者已通过表达Sr－PCS2的酵母对该基因功能进行了研究［11］.本研究拟通过构建含有SrPCS2cDNA的大肠杆菌表达载体，通过原核表达与纯化得到SrPCS2，为体外研究SrPCS2的活性及催化机制奠定基础.1 材料和方法1.1 菌株和质粒大肠杆菌菌株：大肠杆菌（E.coli）DH5α，BL21（DE3）由本实验室保存.表达载体：pMAL－c2x（BioLabs）与pAM47（作者构建并保存）.1.2 主要试剂各种限制性核酸内切酶和连接酶购自大连宝公司（TaKaRa），Amylose填料、MBP单克隆抗体购自Novagen公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（H＋L）二抗购自Invitrogen公司；硝酸纤维素膜购自Amersham公司；其它为国产分析纯或分子生物学级产品.1.3 MBP－SrPCS2的构建重组表达载体的构建见文献［12］，作者已构建了含有SrPCS2的载体pAM47，BamHⅠ位于Sr－PCS2cDNA起始密码子的前面，XbaⅠ酶切位点在终止密码子的后面，用这2个酶双酶切纯化的产物插入到pMAL－c2x相应位点，构建成重组表达载体pAM57.1.4 重组子的筛选和鉴定将构建好的载体转化E.coll、BL21感受态细胞，抗性筛选后提取重组质粒，用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定经过抗性筛选的质粒.1.5 融合蛋白的表达将检测正确的携带有质粒pAM57及pMAL－c2x的BL21（DE3）对照菌株37℃振荡培养过夜，第2d按1%的比例接种于MBP－SrPCS融合蛋白表达所用的培养基，在28℃摇2～3h至D600为0.6～0.8，加入0.2mmol/L IPTG诱导，不同时间收集1 mL菌，离心收集菌体，用9倍体积的PBS重悬菌体.融合蛋白经SDS－PAGE电泳检测.1.6 重组蛋白 MBP－SrPCS2的 Western blotting检测将已表达的融合蛋白 MBP－SrPCS2样品经SDS－PAGE分离后电转至硝酸纤维素膜上.用封闭液封闭2h后加一抗（在侧摆摇床上缓慢摇动2h，再用洗涤液洗3次）及二抗（在侧摆摇床上缓慢摇动1h，再用洗涤液洗3次），最后荧光显色检测.1.7 MBP－SrPCS2融合蛋白的纯化按前述的条件培养1L的菌液，4 000 g，4℃离心20min收集菌体，加入50mL MBP亲和缓冲液，然后冰浴中超声处理（参数为：1mm探头、工作4s、间隔4s、进行80次），超声处理完毕，4℃，14 000 r/min离心15min回收上清，用0.45μm滤膜过滤，得到可用于过柱纯化的蛋白样品.将体积2mL BioLab公司生产的树脂（Amylose Resin）灌入10 mL的柱子，用8倍体积的MBP亲和缓冲液洗柱，将蛋白样品上柱，控制流速1mL/min，用12倍柱床体积的MBP亲和缓冲液洗柱，再用洗脱缓冲液洗脱，按每管1mL收集开始的10管洗脱液.2 结果与分析2.1 重组表达载体的构建及鉴定将构建好的pAM57转化BL21，提取抗性平板上生长良好菌落的质粒用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，酶切片段的大小为1 500bp左右，符合预期大小，证明载体的构建是成功的，并且已经成功的导入了BL21（图1）.2.2 MBP－SrPCS2融合蛋白的表达及优化图1 表达载体酶切分析Fig.1 Restriction endonuclease analysis of expression vector对照菌和阳性菌分别于37℃振荡培养，至D600为0.6，加IPTG 至终浓度0.2mmol/L，诱导培养不同时间收集1mL菌液，离心收集菌体，制备样品并进行SDS－PAGE电泳分析.从图2可以看出，所得到的融合蛋白的大小为60ku，SrPCS2编码177个氨基酸，表明已表达出融合蛋白MBP－SrPCS2，诱导3h时的表达量最高.离心收集诱导3h的菌液，加入300μL超声裂解液，经超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS－PAGE电泳（图3），结果表明MBP－SrPCS2融合蛋白在28℃表达主要以包涵体的形式存在.温度是影响大肠杆菌表达蛋白可溶性的主要因素.改变表达的温度，在15℃的条件下，表达16h，离心收集菌体，制备样品并进行SDSPAGE电泳分析，结果表明可以得到可溶性的MBP－SrPCS2融合蛋白（图4）.图2 MBP及MBP－SrPCS2融合蛋白的表达Fig.2 Expression of MBP－SrPCS2and MBP图3 诱导3hMBP－SrPCS2融合蛋白的表达Fig.3 Expression of MBP－SrPCS2after 3hours图4 在15℃经0.2mmol/L IPTG诱导16hMBP与MBP－SrPCS2融合蛋白的表达Fig.4 Expression of MBP and MBP－SrPCS2in E.coil BL21induced with 0.2mmol/L IPTG after 16hours at 15℃2.3 MBP－SrPCS2融合蛋白的检测将15℃条件下表达的样品经SDS－PAGE电泳后，用电转仪将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，进行Western blotting检测，表明经IPTG诱导，在15℃下表达得到了符合要求的蛋白（图5）.2.4 MBP－SrPCS2融合蛋白的纯化图5 MBP－SrPCS2的蛋白印迹分析Fig.5 Western－blot of MBP－SrPCS1按上面的条件用1L的MBP－SrPCS 2融合蛋白表达所用的培养基摇菌，培养基中必须加葡萄糖抑制大肠杆菌宿主菌染色体上麦芽糖酶基因的表达，它表达的产物是一种麦芽糖酶，能够降解麦芽糖亲和填料.16h后离心收集菌体，制备样品按照麦芽糖亲和层析柱的说明进行纯化，1mL每管收集洗脱样品，取10μL进行SDS －PAGE检测.从图6可以看出表达蛋白得到了初步的纯化，纯化的蛋白中主要是目的蛋白，集中在前3管中.图6 MBP－SrPCS2的纯化Fig.6 Purification of MBP－SrPCS13 讨论尽管大肠杆菌表达系统在表达真核基因时，表达后的蛋白质加工过程不同于真核生物，但大肠杆菌是第1个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，成为基因工程中主要应用的表达系统［13］.但许多外源蛋白在细菌胞内是以包涵体形式表达，需经过变性、复性等复杂过程才能重新折叠成具有活性的可溶性蛋白质.因此如何在大肠杆菌中高效表达可溶性外源蛋白质，仍引起研究者们的关注.PCS是重金属的强螯合物，有助于重金属尤其是Cd2＋在液泡中的累积［14］.它们是以GSH或者含有巯基的相关蛋白为底物，在植物螯合肽合成酶的催化下合成的.将目的蛋白在大肠杆菌内高效表达，从而获得大量、高纯度且具有生物活性的目的蛋白是体外研究酶活性的重要方法.本研究选择MBP融合表达体系是因为MBP作为原核生物的组成蛋白，具有与分子伴侣相似的功能，可以辅助外源蛋白质在大肠杆菌细胞内的正确折叠［15］.而且也有试验证实，通常表达系统中只能以包涵体形式表达的许多蛋白质，在MBP融合表达体系中则能以可溶性形式表达［16－17］.同时，利用支链淀粉亲和层析，可以很方便地将融合蛋白从细菌裂解液中纯化出来.本研究在28℃诱导表达的融合蛋白MBP－SrPCS2，虽然表达量很高，但是绝大部分都是包涵体沉淀，可能是PCS蛋白本身含有较多的Cys残基，蛋白质合成速度太快，以至于Cys残基上琉基间二硫键的错误形成提高了蛋白本身错误折叠的机率［18－19］，而把诱导温度降至15℃时，可以明显提高可溶性目的蛋白的含量，并且表达水平较高，表明诱导温度可影响原核表达蛋白质的可溶性.经Amylose亲和层析得到了纯化的MBP－SrPCS2，为进一步研究其催化活性及PCS的催化机制奠定了基础.参考文献［1］Rauser W E.Phytochelatins and related peptides：structure，biosynthesis，and function［J］.Plant Physiol，1995，109（4）：1141－1149［2］Cobbett C S，Goldsbrough P.Phytochelatins and metallothioneins：roles in heavy metal detoxification and homeostasis［J］.Annu Rev Plant Biol，2002，53：159－182［3］Grill E，Loffler S，Winnacker E L，et al.Phytochela－tins，the heavy－metal－binding peptides of plants，are synthesized from glutathione by a specific gamma－glutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase （phytochelatin synthase）［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86（18）：6838－6842［4］Cobbett C S.A family of phytochelatin synthase genes from plant，fungal and animal species［J］.Trends Plant Sci，1999，4（9）：335－337 ［5］Clemens S，Kim E J，Neumann D，et al.Tolerance to toxic metals by agene family of phytochelatin synthases from plants and yeast［J］.Embo J，1999，18（12）：3325－3333［6］Ha S B，Smith A P，Howden R，et al.Phytochelatin synthase genes fromArabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe［J］.Plant Cell，1999，11（6）：1153－1164［7］Vatamaniuk O K，Mari S，Lu Y P，et al.AtPCS1，a phytochelatin synthase fromArabidopsis isolation and in vitro reconstitution［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（12）：7110－7115［8］Vivares D，Arnoux P，Pignol D.A papain－like enzyme at work：native and acyl－enzyme intermediate structures in phytochelatin synthesis ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（52）：18848－18853［9］Romanyuk N D，Rigden D J，Vatamaniuk O K，et al.Mutagenicdefinition of a papain－like catalytic triad，sufficiency of the N－terminal domain for single－site core catalytic enzyme acylation，and C－terminal domain for augmentative metal activation of a eukaryotic phytochelatin synthase［J］.Plant Physiol，2006，141（3）：858－869［10］Vatamaniuk O K，Mari S，Lang A，et al.Phytochelatin synthase，a dipeptidyltransferase that undergoes multisite acylation with gamma－glutamylcysteine during catalysis：stoichiometric and site－directed mutagenic a－nalysis of Arabidopsis thaliana PCS1－catalyzed phytochelatin synthesis［J］.J Biol Chem，2004，279（21）：22449－22460［11］Li A M，Yu B Y，Chen F H，et al.Characterization of the Sesbania rostrata phytochelatin synthase gene：alternative splicing and function of four isoforms［J］.Int J Mol Sci，2009，10（8）：3269－3282［12］Joseph Sambrook，David W，Russell.Molecular cloning：a laboratory manual［M］.3rd.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002［13］樊瑞泉，罗建勋，杨孝朴，等.微小牛蜱Bm86 基因的克隆与原核表达［J］.甘肃农业大学学报，2007，42（1）：15－19［14］Zenk M H.Heavy metal detoxification in higher plants：a review ［J］.Gene，1996，179（1）：21－30［15］Lauritzen C，Tüchsen E，Hansen P E，et al.BPTI and N－terminal extended analogues generated by factor Xa cleavage and cathepsin C trimming of a fusion protein expressed in Escherichia coli［J］.Protein Expresson and Purification，1991，2（5－6）：372－378［16］雷荣悦，乔玉欢，闫继东，等.重组人BMP6在大肠杆菌中可溶表达、纯化及活性分析［J］.生物工程学报，2008，24（3）：452－459［17］高凤山，夏春，张强，等.大肠杆菌表达的重组猪β2微球蛋白二级结构的圆二色谱分析［J］.微生物学报，2009，49（12）：1596－1600［18］Philip A R，Olena K V，Daniel J R.Weeds，worms，and more.Papain＇s long－lost cousin，phytochelatin synthase［J］.Plant Physiology，2004，136（1）：2463－2474［19］Mitraki A，Fane B，Pettingell C H，et al.Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation［J］.Science，1991，253（5015）：54－58。

PET32a质粒序列什么是PET32a质粒?PET32a质粒是一种常用的表达载体，广泛应用于蛋白表达和纯化领域。

它是一种环状的DNA分子，具有特定的序列和结构，可以用来携带外源基因并在宿主细胞中进行复制和表达。

PET32a质粒的结构PET32a质粒由多个功能区组成，每个区域都有不同的作用。

以下是PET32a质粒的主要结构和功能区域：1.起始子区：起始子区包含启动子序列，这是一个DNA序列，可以与宿主细胞中的转录因子结合，并启动目标基因的转录过程。

2.多克隆位点(MCS)：MCS是一个包含多个限制性内切酶切位点的区域。

这些切位点允许将外源基因插入到质粒中，并确保插入后能够正确进行转录和翻译。

3.信使RNA稳定性序列：这个序列能够增加目标基因mRNA的稳定性，从而提高蛋白表达量。

4.His标签：His标签是一个由6个组氨酸残基组成的多肽序列。

它可以用来方便地纯化目标蛋白，因为具有亲和性镍离子的树脂可以与His标签结合。

5.T7启动子：T7启动子是一个特殊的启动子序列，可以与T7 RNA聚合酶结合并导致目标基因的高效转录。

6.抗生素抗性基因：质粒中通常包含一种抗生素抗性基因，例如ampicillin抗性基因。

这样可以通过在含有相应抗生素的培养基上进行筛选，选择出带有质粒的细胞。

PET32a质粒的应用PET32a质粒在过去几十年中被广泛应用于蛋白表达和纯化领域。

以下是PET32a质粒的一些主要应用：1.异源蛋白表达：PET32a质粒可以用来表达各种异源蛋白，包括重组蛋白、荧光蛋白等。

通过将目标基因插入MCS区域，宿主细胞会转录和翻译该基因，并产生目标蛋白。

2.His标签纯化：由于PET32a质粒中含有His标签序列，因此可以使用亲和性树脂结合His标签，将目标蛋白高效纯化。

3.T7表达系统：PET32a质粒中的T7启动子可以与T7 RNA聚合酶结合，并导致高效的基因转录。

这使得PET32a质粒成为一个理想的工具，用于大规模生产需要大量目标蛋白的实验。

慢病毒包装总结慢病毒的成分现在的慢病毒包装系统通常包括几个质粒，这几个质粒上分别含有慢病毒复制的成分，这样做的目的就是为了增加安全性，毕竟如果只用一个成分的话，危险系数很高，人一旦接触这种病毒就有可能遇到危险。

而把这几个成分分散在几个质粒中，很难在体外形成危险的病毒颗粒。

第二代慢病毒包装系统含有3个质粒，第3代慢病毒包装系统含有4个质粒。

这两代病毒包装系统都含有以下相同的成分：第一，编码目的蛋白或转录目的基因的转移质粒。

其实就是你自己的目的质粒，也就是通常需要自己做载体的质粒。

目的基因的两侧都含有长末端重复序列（LTR，long terminal repeat），LTR的作用就是辅助目的基因插入到宿主细胞的基因组。

许多慢病毒质粒都是基于HIV-1病毒改造的。

为了安全目的，这些目的质粒的复能能力并不完全，它们的3'LTR有所删减，这样病毒插入到基因组后会自我失活（self-inactivating）（SIN）。

第二，包装质粒，毒包装的结构蛋白编码质粒。

第三，包膜质粒，编码蛋白质外壳。

第二代慢病毒利用病毒的LTR启动子用于基因的表达，第三代慢病毒利用一个杂合的LTR启动子进行基因表达。

第二代慢病毒下图是第二代慢病毒系统：这个系统含有3个质粒，第1个质粒：包装质粒，它编码Gag，PoI，Rev与Tat基因。

第2个质粒：包膜质粒，含有VSV-G，编码蛋白Env。

第3个质粒：目的质粒，含有病毒的LTRs和psi包装信号（图片未画出），除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件的来激活它。

所有的第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，因此它的LTR是Tat依赖性的。

第三代慢病毒第3代慢病毒如下所示：设计第3代病毒的目的主要还是提高安全性。

在第3代病毒中，将第2代病毒的包装质粒分成了2个质粒，一个编码Rev，另外一个编码Gag和PoI。

phis2质粒序列-回复「Phis2质粒序列」为主题的文章：解读构建与应用Phis2质粒序列是在分子生物学研究中广泛应用的一种工具，通过插入特定的DNA序列，可以实现基因的表达、克隆和传递。

本文将一步一步回答关于Phis2质粒序列的构建与应用。

第一步：什么是Phis2质粒序列？以及它的构建原理。

Phis2质粒序列是一种含有DNA片段的人工圆形DNA分子。

它由质粒骨架和DNA片段构成，质粒骨架通常包含起始子、终止子和复制起始位点等功能序列，用于表达和复制所插入的DNA片段。

构建Phis2质粒的过程可以通过以下步骤实现：1. 选择合适的质粒载体：通常从已有的质粒中选择骨架进行改造，选择具有较高复制能力、对外源基因稳定的质粒。

常用的载体有pUC、pBR322等。

2. 得到目标DNA片段：使用PCR或其他方法，在受体DNA或基因组中扩增需要插入的DNA片段。

这个片段可以是一个基因、一个启动子、一个编码序列等。

3. 限制酶消化：使用特定的限制酶切割选择的质粒骨架和目标DNA 片段。

4. 连接：将骨架和目标DNA片段通过DNA连接酶的作用连接起来。

连接的过程中可以使用连接接头如AP拼接。

5. 转化至宿主细胞：将构建好的Phis2质粒通过热激转化、电穿孔等方法导入宿主细胞中。

第二步：Phis2质粒序列的应用领域Phis2质粒序列在分子生物学研究中有着广泛的应用。

以下是几个常见的应用领域：1. 基因表达：通过将目标基因插入Phis2质粒中，可以实现外源基因的表达。

在希望大量表达某个蛋白质的研究中，研究人员可以将该蛋白质的编码序列插入Phis2质粒，并将其导入宿主细胞进行表达。

2. 克隆：Phis2质粒构建方法可以用于分子生物学的克隆操作，如基因克隆等。

通过将目标DNA片段插入Phis2质粒中，可以实现序列的复制和扩增，并进一步进行序列分析和功能验证。

3. 细胞传递：Phis2质粒还可用作载体，将目标基因导入到宿主细胞中。

pET-3a(+)pET-3c-sumo pET-3d(+)pET-11a(+)pET-12a(+)pET-15b(+)pET-16b(+)pET-17b(+)pET-19b(+)pET-20b(+)pET-21a(+)pET-21b(+)pET-21d(+)pET-22b(+)pET-23a(+)pET-23b(+)pET-24a(+)pET-25b(+)pET-26b(+)pET-27b(+)pET-28a(+)pET-28b(+)pET-28c(+)pET-28a(+)-sumo pET-28a(+)-GFP pET-28a(+)-SMT3 pET-29a(+)pET-30a(+)pET-30c(+)pET-31b(+)pET-32a(+)pET-32a(+)pelB pET32a-LC3pET-32a(+)LicpET-35b(+)pET-38b(+)pET-39b(+)pET-40b(+)pET-41a(+)pET-42a(+)pET-43.1a(+)pET-44a(+)pET-49b(+)pET-50b(+)pET-52b(+)pMCSF1pMSCF3pRSFDuet1 pCDFduet1pColA duetE.coli EPI300Ecoli MC1061BL21BL21goldBL21(DE3)BL21(DE3)plysSBL21(DE3)GoldplysS BL21AIBL21SIBL21codonplusRIPL BL21codonplus（DE3) BL21TrxB（DE3)BL21（DE3)RDBL21Star（DE3）BL21RPBL21RILRosetta(DE3)Rosetta(DE5)Rosetta Blue(DE3) Rosetta(DE3)plysS Rosetta2(DE3)Rosetta2(DE3)plysS Rosetta-gami(DE3) Origami(DE3)Origami2(DE3) OrigamiB(DE3)Origami(DE3)plysS Rosetta-gami 2(DE3)placI Rosetta-gami 2(DE3)pLysS Rosetta-gami B(DE3)pLysS BLR(DE3)Novablue（DE3)B834(DE3)JM83AD494（DE3)HM174（DE3）HM174（DE3）plysSC41(DE3)C41(DE3)plysSC43(DE3)Turner（DE3）Turner（DE3）plysSJM101JM105JM109JM109（DE3)DH5aλpirK12MG1655XL1blueXL10 goldTop10Top10F’BM25.8BW23473SG1117TurboT1TG1TB1M15ER2566C2566ER2529ER2738HB2151S-17SM10JF1125BJ5183HB101K802C600JM110TH1AM1W3110DH10bacY1089Y1090Antarctic Express Antarctic Express(DE3) Antarctic Express(DE3)RP Antarctic Express(DE3)RILDH5αJM110TOP10XL2-Blue MRF’Mach1 T1OmniMAX2 T1 Phage-Resistant Cells EZ10DH10BSUREpubs 520DB3.1pCold IpCold IIpColdIIIpCold-sumopCold-TFpPin point xa1pPin point xa2pPin point xa3pPin point CATpMAL-c2xpMAL-p2xpMAL-p5xpMAL-c5xpMAL-c4xpMAL-p4xpMAL-p5epTWIN1pTWIN2pLLP-OmpApLLP-STIIpMBP-PpMBP-CpET-TrxpET-HispTrc-CKSpET-DsbApET-MBPpET32M3CpGEX-4T-3pGEX-5x-1pGEX-6p-1pGEX4T-1/Gst-His-HA pGEX3XpGEX-1λT-6His-GST-PP pGEX2tkpkk223-3pkk232-8pBV220pBV221pBV222pRsetApRsetBpRsetCpRsetB td Tomato pBBRMCS pBBRMCS2 pBBRMCS3 pBBRMCS4 pBBRMCS5pTrcHisApTrcHisBpTrcHisCpBADHis ApBADHis BpBADHis CpBADMycHisA pQE2pQE9pQE30lacIqpQE30pQE31pQE32pQE40pQE60pQE70pQE80L pQETrisystem pEZZ18pSE380pWHM3pQBI63pTrc99A pTrcMECTpTrcpTYB1pTYB2pTYB11pTYB12pCYB1pBAD18pBAD24pBAD33pBAD43pBAD24-GFP pDest15-N-throbin pDest22pDest32pED-Trx-pp-air pED-pppED-DsbA-pp-airpED-GST-pp-airpCWori+pITG TrxpT7tspTT5pALEXpUC18pUC19-GFPpUC19pUC18-p43pUC118pGEM3ZF+pEGM-7ZF(+)pEGM-11ZF(+)pKT100pME6032SuperCosmidpBR322pACYC184pACYC177pBluescript II SK(+) pBluescript SK(+) pBluescript II KS(+)pG-KJE8pGro7pKJE7pG-Tf2pTf16pEC86pET-28a-fabppETcoco-1酵母杂交系统pACTpACT-MyoDpBIND-IdpG5 lucpCMV-BDpCMV-ADpBD-p53pBD-NF−κBpAD-SV40TpAD-TRAFpFR-lucpGBKT7pGADT7pCL1pGBKT7-53pGADT7-TpGBKT7-LampACT2 ADY187AH109pSospMyrpSos MAFBpHis2pHisSi-1p53bluepGAG424pLaczip53hispGAD53mpBridgeY2H Gold Yeast strain Y187pINDpOPRSVIpOPI3CATpCMVLacIpSwitchpGene v5-His BpcDNA4/TO/Myc-His A pcDNA4/TO/Myc-His B pcDNA4/TO/Myc-His C pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ pcDNA6/TRpTet-OnpTet-OffpTRE2pTRE2 hygropTK-hygpRevTet-OnpRevTet-OffpRevTREpTet on advancedpTRE TightpTRE Tight Luciferase pCMV-Tet3GpTRE3GpTRE3G-LucpNI v2pNG v2pNN v2pHD v2pTALETF v2 (NN) pTALETF v2 (NG) pTALETF v2 (NI) pTALETF v2 (HD) pTALEN v2 (NI) pTALEN v2 (NG)pTALEN v2 (NN)pTALEN v2 (HD)pX335pX260pX320pShuttle-CMVpShuttlepAdTrack-CMVpAdTrackpAdEasy-1BJ5183AdEasy-1pAd/BLOCK-iT-DEST RNAi Gateway Vector pDC315pBHGloxdelE13crepShuttle-IRES-hrGFP2pAAV-MCSpAAV-RC2pAAV-RCpHelperpAAV-LacZpAAV-IRES-hrGFPpCMV-MCSRNAi-Ready pSIREN-RetroQRNAi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen pSilencer5.1-U6-RetropSilencer5.1-H1-RetropRetroX-IRES-ZsGreen1pRetroX-IRES-DsRed ExpresspLNCX2pQCXIHplvx-RNA1plvx-RNA2pMSCVpuropSuperpSuper retro GFP-neo pSupeior puropBabe puropCMV-Gag-polpCMV-VSV-GpCL AmphopSuper retro puropLVX-shRNA1pLVX-shRNA2pSicoRpSicoR pGK puro pLentilox 3.7pLKO.1 puroPLKO.1pLKO.3GpTet-PLKO-puro pPRIME-TET-GFP-FF3 pPRIME-TREX-GFP-FF3 pSIH1-H1-CoGFPpGIPZ emptypGIPZ controlpTRIPZ emptypTRIPZ controlpLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-AcGFP1-N1pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-td Tomato pLVX-IRES-mCherry pLVX-IRES-neopLVX-IRES-puropLVX-puropLVX-Tight-PuropLVX-Tet-On-AdvancedpLVX-TRE 3GpLVX-Tet 3Gplvx-i-TDpLenti4 TO/V5 DESTpLenti6 V5 DESTpLenti6-UbC-V5-DESTpCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pCDH-CMV-MCS-EF1-puro pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pWPXLFUGWpLVTHpLVTHMpLp1pLp2pLp VSV GpCgpVpVSV GpCMV-dR8.91pCMV-VSV-GpSPAX2pMD2.GpMDLg pRREpRSV-revpCMV-VSV-GpLentG-KOSMTetO-FUW-OSKMFUW-M2rtTAFUW-tetO-hOCT4FUW-tetO-hSOX2FUW-tetO-hKLF4FUW-tetO-hMYCpCDF1-MCS2-EF1-copGFPpFP93LeGO-iC2pLOX-CW-CREpLOX-CWBmi1pLOX-TERT-iresTK pLOX-Ttag-iresTK pGensil-1Stbl3Stbl4Stbl4PiggyBac Dual promoter Super PiggyBac Transposase pGAS-TA-LucpSTAT3-TA-LucpISRE-TA-LucpTA-LucpIκB-EGFPpNFAT-TA-Luc pCaspase3-sensorpAP1(PMA)-TA-Luc pCRE-LucpGRE-LucpHSE-Lucp53-LucpAP-1-LucpNF-κB-Lucp38-betap38-бp38-γπp-JNKK2pCDNA3.1-flag-TRAP2 pCDNA3.1-flag-TAK1HA-ASK1pCDNA3-myc-MEKK3pCMV-MDMZpEGFP-N1-raf通路pSRE-LucpGL4.10pGL4.13pGL4.19pGL4.26pGL4.27pGL4.29pGL4.30pGL4.75TOPFlashFOPFlash SuperTopFlashpE2F-TA-LucpSilencer1.0pSilencer 2.1-U6 hygro pSilencer3.0-H1 pSilencer 3.1-H1 hygro pSilencer 3.1-H1 neo pSilencer 4.1-CMV neo pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase pSV-β-galacosidase psiCHECK-2pmir GLOpGenesil-1pmR mCherrypmiRZip anti-microRNA pRNATin-H1.2/Neo pRNATin-H1.2/Hygro pRNATin-H1.2/Retro pRNA-H1.1/Adeno pYES2pYES2-EGFPpYES2-KanpYES2-flagpYES3/CTpYES6/CTpYES2 NTApYES2 NTBpYES2 NTCpFA6a-GFP(S65T)-His3MX6_1x pFA6a-GFPS65T-KanMX6 pESC-LeupESC-TrppESC-HispESC-UrapRS316pRS316HApRS426pRS426galpRS41HpRS41H-启动子pYCP211pYIP5pYRP7pYX212pYIP211pADH2PACT2-ADpDR195p416GFDpYEplac112pYEplac195Ycp22lac-EGFPYcplac33pAUR123pUG6pUG35pSH65pSH63pSH47 INVSc1S288cW303-1ABY4741BY4742FY837YPH499YS58YM4271 pPIC9pPIC9kpPIC9khis pPIC9kmut pPICZalphaA pPICZalphaB pPICZalphaC pPICZA pPICZB pPICZC pGAPZalphaA pGAPZalphaB pGAPZalphaC pGAPZA pGAPZB pGAPZC pPIC.5k pPIC3.5pAO815 pPink HCpPink LCpPink HC alphapMET αBpMET αCpPIC ZαGBpPIC ZαFCpPIC ZαDpHIC-PILA503ZαGApFLD-catp334BFD15pink1pink2pink3pink4SMD1168SMD1168HSMD1163KM71KM71HGS115GS190GS200JC308JC220pENTR 1ApENTR3CpDONR221pDONR ZeopcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative pLenti6/TRDB3.1pYD1EBY100pDisplay植物载体pcambia35s-EGFP pcambia2301-101 pcambia35s-EYFP pcambia35s-ECFPpTCK303pBI101pBI221-GFPpBI121pBI121-GFPpcambia1300-221Super1300pcambia1300GFP pcambia 1200pcambia1201pcambia12811Zpcambia1300pcambia1301pcambia1302pcambia1303pcambia1304pcambia1305.1pcambia1305.2pcambia1380pcambia1381xcpcambia1381xapcambia1381pcambia1381xbpcambia1381Zpcambia1390pcambia1391pcambia1391Zpcambia1391xapcambia1391xcpcambia1391xbpcambia2200pcambia2300pcambia2301pcambia0380pcambia0390pcambia2201pcambia1291ZATCC15834 发根农杆菌LBA9402pKANNIBALpHANNIBALpGreen029pSPYCE（M）pSPYCE（MR）pspYCEMpspYCEMRpspYNE173pspYNE173RpSAT4 nVenus-CpSAT1 CCFP-NpSAT1 CCFP-CpPZp-RCS2-BarpSAT6 nCerulean C(A+)p416GFDpDF15枯草芽孢杆菌表达系统pMUTIN4pMUTIN4GFPpCSN44pMA5pMA5MCSpMA-H3pMA09-JpMA09-HpHY300pHY300plkpXMJ19pIL253pZL507pDG1363pSG1154pHT304pHCMC04 pHCMC05pAD43-25pMA5pMA5MCSpGFP315pGFP22pHT01pHT43BCL10501A75WB600BS168WB600WB800WB800NpHIS1525pK18mobSacB巨大芽孢菌 WH320巨大芽孢菌YYB pHT1谷氨酸棒杆菌ATCC13032其他酵母表达系统pKLAC1GG499pSEP1pSEP2pSEP3粟酒酵母SP01粟酒酵母SPQ01T载体系列pCXSNpCUXNpXDGpXDR细胞通路载体p38-betap38-бp38-γπp-JNKK2pCDNA3.1-flag-TRAP2 pCDNA3.1-flag-TAK1HA-ASK1pCDNA3-myc-MEKK3 pCMV-MDMZpEGFP-N1-raf通路JM109 MEKK1 fl pcDNA3-HA-TAB1ERK （WT）Pgex4t1-GST-IKB pSicheck2pQCXINpDONR221Top10 pROSEJM109 MEKK1 fl ERK （WT）pBabc-puroHA A8F1HAcdc37pcMV flag MEKK1 pBARK1pBD67其他表达系统pOS7001pHGF9050pIJ8860pRK2013pVLT33pJLA 502pIL253PSM-402pAP-B03pECX99EpXJM19pCS2-HApDG148pMK3S17-lamda pir pMG36ePYCTpNZ8048MG1363NZ9000pBIG2R-HPH2pAN7-1pAN8-1pKC1139哺乳动物真核表达质粒pSR-GFP/NeopVAX1pBudCE4.1pSFV1pCEP4pUB6/V5 His ApUB6/V5 His BpUB6/V5 His CpUB6/V5 His lacZpCMV5pCMV-Tag 2 BpCMV-Tag 5BpSecTag2 ApNTAP-BpBK-CMVpTracer CMV2pSG5pCI-neopCIpSIpCMV-mycpCMV-HApIRESpIRES neopIRES neo3pIRES hyg3pIRES puro3pIRES2-EGFPpIRES-hrGFP-1a pIRES-Dsred-Express pBI CMV1pFLAG CMV2pVitro2-neo-mcs pCAGGSpWHEREpBC1pcDNA4T/0pcDNA4/V5-His A pcDNA6TRpCDNA3.0-GFPpCDNA3.0pcDNA3 flagpcDNA3 EGFPpcDNA3.1HApcDNA3.1MycpcDNA 3.1-c-His/myc pcDNA3.1(+)/Myc HisB pcDNA3.1(zeo)+ pcDNA3.1/GSpcDNA3.1(-)/myc-His A pcDNA3.1-V5-HisA pcDNA3.1-CT-GFP pcDNA3mito RFP pcDNA4/HisMax B pcDNA6-Myc/His B pIE1pIEX-bac3pCDNA6 myc His C pfastbacIpFastBacIIIpFastBacI-Gus pFastBacHT ApFastBacHT B pFastBacHT C pFastBacHT-CAT pFastBacDualpFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 B pBlueBacHis2 CpIEXBac-1pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4pVL1392pVL1393pVL1392-XyIE control vector pCo-blastpAc5.1apAc5.1bpAc5.1 V5-His BpMT/V5 HispMT-Bip-V5-HisApEF1/myc-His BpEF1/V5 HisApEF4/V5 HisApEF6/Myc-HisCpMIB v5-His BpIZT/V5-Hissf9细胞High Five细胞DH10BacpFBDMpUCDMpBADZ-His6CreDH10MultiBac pDsRed2-N1 pDsRed2-C1 pDsRED-Monomer-N1 pDsred2-4T-1 pDsred2-32a pscherry1pmCherry-N1 pmCherry-C1pRFP-N3pEYFP-N1pEYFP-C1pEGFP-N1pEGFP-C1pEGFP-N3pEGFP-C3pECFP-N1pECFP-C1pEGFP-1pAcGFP1-1pDsRed2-1 pZsYellow-N1 pAmCyan-N1 pLEGFP-N1 pLEGFP-C1 pDsRED2-ER pDsRED2-Mito pDsRED2-Nuc pDsRED2-Peroxi pDsred-Express C1 pEYFP-GolgipEYFP-MempEYFP-ERpEYFP actinpEYFP tubpEGFP-ActinpECFP-ERpECFP-Mito pPAmCherry-Tubulin mRFP-ERDkeima fluorescent protein mAmetrinepDsRed-Monomer pEBFP-N1pEBFP-C1pEBFP-C2pAcGFP1-1pGreen0029pSicor EGFPpCDNA3.1（-）-MRFP pGL3-basicpGL3-controlpGL3-enhancerpGL3-promoterPGL3-SV40PGL3-CM 转DH6αpRL-TKpRL-CMVpRL-SV40pGluc-basicpSIM5pSIM6pKD3pKD4pKD20pKD46PCP20基因野生型P53myc-hTERTSV40 Large TTaqklentaqPfuKODT4 DNA ligaseT4 PNKTEVSUMOSUMO protease 2pP-αSUMO3GST-3CLYZ-pPICZα(溶菌酶表达毕赤酵母载体）Vaccinia viru Topoisomerase Imouse RITNFTGFLysozymeM-MLVM-MLV(-)CreCCDB-TsfGFP大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（klenow）大肠杆菌DNA聚合酶I普通微生物菌种红发夫酵母（自己分离）酿酒酵母S288c（自己分离）葡萄牙假丝酵母(自己分离）多形汉逊酵母 NRRL Y-11170白色念珠菌ATCC 10231酿酒酵母 S.c197管囊酵母(自己分离）原毛黄孢平革菌 ATCC 34540热带假丝酵母 NRRL Y-12968马其顿假丝酵母CICC 1765巴斯德假丝酵母 NRRL Y1603三角酵母（自己分离）南极假丝酵母NRRL Y-7954 Ash bya gossypii NRRL Y-1056酿酒酵母 CGMCC2.1多形汉逊酵母 NRRL Y-11170出芽短梗霉 CICC40333黑曲霉（自己分离）简青霉CGMCC3.4402热带假丝酵母 CICC 1272树干毕赤酵母 NRRL Y-11545光滑假丝酵母NRRL Y-65长娄德酵母CGMCC2.1589季也蒙毕赤酵母CGMCC2.1801克鲁维酵母K.aestuarii Y-5370出芽短梗霉 NRRL Y-2311-2出芽短梗霉（自己分离）出芽短梗霉 ATCC 62921美季假丝酵母CGMCC2.1919安格斯毕赤酵母 NRRL Y-2214德巴利汉逊酵母NRRL Y-2021解脂亚罗酵母 CICC1441白色假丝酵母CGMCC 2.538卡尔斯博厄酵母 CICC1746赭色掷孢酵母CGMCC2.2113赭色掷孢酵母NRRL Y-5483简青霉（自己分离）乳酸克鲁维酵母CICC1773近平滑假丝酵母 CGMCC2.1786构巢曲霉ATCC38163博伊丁假丝酵母 NRRL Y-2332-2荚膜毕赤酵母 NRRL Y-1842博伊丁假丝酵母 NRRL Y-2332安格斯毕赤酵母 NCYC 495绿色木霉 NRRL3652大毛霉 NRR3635黑曲霉 NRR566米根霉（自己分离）嗜热脂肪地衣芽孢杆菌 NRRL B-1102嗜热脂肪地衣芽孢杆菌 NRRL B-1172嗜热脂肪地衣芽孢杆菌 NRRL B-14316嗜热脂肪地衣芽孢杆菌 NRRL B-14318解淀粉芽孢杆菌 CGMCC1.1099地衣芽孢杆菌 ATCC33632巨大芽孢杆菌NRRL B-14308巨大芽孢杆菌CGMCC 1.223蜡状芽孢杆菌 NRRL B-3711嗜碱芽孢杆菌ATCC BAA-125蜡状芽孢杆菌 CICC10040地衣芽孢杆菌 ATCC 14580巨大芽孢杆菌 ATCC12872芽孢杆菌 NRRL B-11291紫红红球菌 NICMB 11216紫红红球菌DSM11097紫红红球菌DSM44541赤红红球菌 CGMCC4.1187红串红球菌 CGMCC 1.2362红串红球菌 DSM 43297紫红红球菌 CGMCC 1.2348紫红红球菌 DSM6263紫红红球菌 DSM46022紫红红球菌 DSM363紫红红球菌DSM43002嗜吡啶红球菌JCM10940恶臭假单胞菌 NRRL-18668荧光假单胞菌 DSM7155荧光假单胞菌CGMCC 1.758洋葱假单胞菌（自己分离）绿叶假单胞菌 CICC10216洋葱假单胞菌（自己分离）野油菜黄单胞菌 DSM3586丁香假单胞菌 ATCC BAA-978粪产碱杆菌CGMCC1.767粪产碱杆菌ATCC8750反硝化产碱杆菌N4谷氨酸棒杆菌ATCC13032金黄节杆菌ATCC BAA-1386藤黄节杆菌 CGMCC1.1525柠檬黄节杆菌CGMCC1.1893植物乳杆菌 NCIMB8826鲍曼不动杆菌 CICC22934鲍曼不动杆菌CICC22934醋酸钙不动杆菌NCIMB9871糖多孢菌 NRRL 2338四联球菌 NRRL B-108肺炎链球菌ATCC 49619肺炎克雷伯氏菌（自己分离）敏捷食酸菌72w睾丸酮丛毛单胞菌 ATCC55746运动发酵单胞菌 ZM4嗜水气单胞菌2（自己分离）嗜水气单胞菌1（自己分离）睾丸酮丛毛单胞菌 ACCC10192睾丸酮丛毛单胞菌 ATCC 55744聚团斯塔普氏菌JCM 20685耐辐射甲烷菌JCM2831四联球菌NRRL B-108金黄色葡萄球菌 ATCC 6538金黄色葡萄球菌ATCC29213臭鼻克雷氏菌CGMCC1.1734哈维氏弧菌ATCC33842河流弧菌CGMCC1.1608副溶血弧菌（自己分离）嗜热假诺卡氏菌CGMCC10280沉积物希瓦氏菌 DSM17055脆壁希瓦氏菌 NCIMB 400农杆菌 NRRL B-11291铅青链霉菌阿维链霉菌 NRRL 8165茎瘤固氮根瘤菌 DSM 5975放射根瘤菌ATCC 33970粪肠球菌ATCC29212粪肠球菌 ATCC 7080洋葱伯克霍尔德菌ACCC 10506根瘤菌ATCC BAA-1182结核分枝杆菌 JCM13017 Prosthecochloris vibrioformis DSM263 Oceanicola granulosus ATCC863质控标准菌株人伤寒沙门菌(自己分离）猪伤寒沙门菌（自己分离）大肠杆菌ETEC大肠杆菌EIEC大肠杆菌EHEC大肠杆菌EPEC苏云金芽孢杆菌ATCC10792枸橼酸杆菌CMCC48001小肠耶尔森菌ATCC23715黄色微球菌ATCC58166宋内志贺ATCC9290阴沟肠杆菌ATCC45031溶藻胶弧菌ATCC17749枯草芽孢杆菌ATCC63501白色葡萄球菌8032鲍曼不动杆菌ATCC19606肺炎克雷伯氏菌ATCC13883甲型副伤寒ATCC9250拟志弧菌ATCC33847河弧菌NCTC11218大肠杆菌ATCC25922创伤弧菌ATCC27526铜绿假单胞菌ATCC27853金黄色葡萄球菌ATCC25923鼠伤寒杆菌ATCC14028单增李斯特菌CMCC54002变形杆菌CMCC49027白色念珠菌ATCC10231副溶血弧菌ATCC17082福氏志贺菌ATCC12022鲍氏志贺菌ATCC9207蜡样芽孢杆菌ATCC11778阪琦肠杆菌ATCC51329表皮葡萄球菌ATCC12228粪链球菌CMCC3200马红球菌ATCC6939大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌报告基因质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒分子伴侣分子伴侣分子伴侣分子伴侣分子伴侣大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母三杂交系统酿酒酵母三杂交系统酿酒酵母三杂交系统蜕皮激素诱导表达系统蜕皮激素诱导表达系统LacSwith II哺乳动物诱导表达系统LacSwith II哺乳动物诱导表达系统LacSwith II哺乳动物诱导表达系统GeneSwith 哺乳动物诱导系统GeneSwith 哺乳动物诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统Tale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kit Tale ToolBox kit CAS9系统CAS9系统CAS9系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统PiggyBac转座子系统PiggyBac转座子系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒。

质粒载体介绍质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）⼀、质粒的基本特性1．质粒的复制通常⼀个质粒含有⼀个与相应的顺式作⽤控制要素结合在⼀起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制⼦）。

在不同的质粒中，复制起始区的组成⽅式是不同的，有的可决定复制的⽅式，如滚环复制和θ复制。

在⼤肠杆菌中使⽤的⼤多数载体都带有⼀个来源于pMB1 质粒或ColE1 质粒的复制起始位点。

图3-1 是其复制其始⽰意图。

在复制时，⾸先合成前RNAⅡ，即前引物，并与DNA 形成杂交体；⽽后RNase H 切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草⼆级结构，该引物引导质粒的复制。

形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成⼆级结构，同时Rop 增强RNAⅠ的作⽤，从⽽控制质粒的拷贝数。

削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作⽤的突变，将增加带有pMB1 或（ColE1）复制⼦的拷贝数。

图3-1 带pMB1（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产⽣的转录的⽅向及其粗略⼤⼩。

2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。

严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，⼤约 1 ～⼏个；松驰型质粒拷贝数较多，可达⼏百。

表5-1 就是不同类的质粒与复制⼦及拷贝数的⼤致关系。

表3-1：质粒载体及其拷贝数（⼀）选择标记抗⽣素抗性基因是⽬前使⽤最⼴泛的选择标记。

1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, amp r）氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使⽤最⼴泛的选择标记，绝⼤多数在⼤肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。

青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。

氨苄青霉素抗性基因编码⼀个酶，该酶可分泌进⼊细菌的周质区，抑制转肽反应并催化β-内酰胺环⽔解，从⽽解除了氨苄青霉素的毒性。

青霉素是⼀类化合物的总称，其分⼦结构由侧链R-CO- 和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）两部分组成。

在6-APA 中有⼀个饱和的噻唑环（A）和⼀个β-内酰胺环，6-APA 为由L- 半脱氨酸和缬氨酸缩合成的⼆肽。