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分子荧光光度法
分子荧光光度法
第一节 概 述
一、光致发光
物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至 激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通 过辐射（发光）或非辐射的形式放出多余的能量，由 激发态重新回到基态。物质分子吸收外来光被激发后 所产生的发光现象，叫光致发光。
荧光 10-9~10-6s 实用 磷光 10-3~10s 不实用
二、荧光光度法
利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含 量的分析方法，称为荧光光度法，即荧光法。
优点：灵敏度高，10-7~10-9g/ml，比紫外分光光度法 灵敏度高10~1000倍。
第二节 基本原理
一、荧光的产生
基态 激发光 激发态 去激发 基态
（一）激发 处于基态的物质分子吸收光能时，其电子 对中的一个电子被激发到某一较高能级。
2、内转移 两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级 重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时 将能量以热的形式传递给溶剂分子。
意义：无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单 重态（如S1、S2、S3……)，它都能通过内转移和振动 驰豫到达S1的最低振动能级上。
一般情况下，S1与S0之间很难发生内转移；T1与S0之 间发生内转移的几率要大些。
第三节 荧光光度计
原理图
荧光测量应在垂直激发光方向上 进行。
一、光源
特点：光强度大，适用范围宽。
常用：高压汞灯，氙灯，溴钨 灯，激光，脉冲激光
二、单色器 干涉滤光片，光栅
三、样品池 石英杯 四、检测器 光电倍增管
日立850型荧光分光光度计
第四节 定量分析方法
原理：一定条件下，荧光强度（If)与浓度(c)呈线性关系。
(4)取代基效应：斥电子基→ψf↑ 吸电子基 →ψf↓ 重原子→ψf↓
2、环境因素 (1)温度 温度↑→荧光效率↓ (2)溶剂 极性↑→ 荧光↑ (3)溶液pH值 影响荧光物质存在形式。因此要严格 控制溶液pH值。
(4)荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等） 3、荧光物质浓度
自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间 碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。
3、体系间跨越
电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为 体系间跨越。常见于含重原子(I、Br)的有机分子中。
4、外转移
激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热 的形式失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的 外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失， 称“猝灭”或“熄灭”。磷光寿命长，发生外转移机 率大，所以室温下很难见到磷光。
If = Kc 定量分析的依据
方法：标准曲线法和标准对比法
第五节 分析条件的选择
线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除
一、线性范围的选择
荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性 关系。
二、选择激发波长和荧光波长
1、激发波长的选择 激发光谱： 将光源发射的激发光用单色器单色后照射物
质，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定 相应的荧光强度，所得荧光强度-激发波长图谱，称激 发光谱。
二、影响荧光的因素
荧光效率： 光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。
1、分子结构
(1)π→π*跃迁能产生较强荧光。——产生荧光的主要 跃迁类型
(2)含π-π共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大， 荧光效率越大。
(3)刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面 性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。
基态单重态 所有电子都自旋配对的分子电子态。
激发态 激发单重态 S1 S2 …… 激发三重态 T1 T2 ……
(二)去激发 指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐 射方式回到基态的过程。
辐射跃迁 荧光
去激发
磷光
振动驰豫
无辐射跃迁 内转移
（热的形式） 体系间跨越
外转移
1、振动驰豫
同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动 能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过 程称振动驰豫。
一般选择最大激发波长作为激发光波长。
2、荧光波长的选择 荧光光谱：用最大激发波长的激发光照射荧光物质
时，依次测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光 强度-荧光波长图谱，称为荧光光谱。
一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。
三、散射光干扰的排除
1、散射光 当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，
还有小部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种 光称散射光。
瑞利散射光 波长与激发光波长一样
拉曼散射光 波长比激发光波长长
2、消除方法 （1）选择适宜的激发光波长
用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的 荧光峰位波长相同 ，但产生的拉曼散射光峰位各不相 同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生 的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。
5、荧光发射 电子由第一激发单重态S1（最低振动能级）跃迁至基
态S0而发射的光叫荧光。 6、磷光发射
电子由第一激发三重态T1跃迁至基态S0而发射的光叫 磷光。
跃迁方式 振动驰豫 内转移 荧光 磷光
时间 10-12 ~ 10-14 S 10-11 ~ 10-13 S 10-6 ~ 10-9 S 10-4 ~ 10 S
45、自己的饭量自己知道。——苏联
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41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
（2）选择合适的溶剂
拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼 散射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光 波长远离荧光波长，而消除其干扰作用。
第六节 应 用
因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量 少等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环 境监测和卫生防疫等领域。
4 、 5 、 6