试验六 小白鼠骨髓细胞染色体制备及观察

实验步骤
预处理——取股骨——冲洗骨髓——离 心——低渗——离心——固定——离心——
滴片——染色——观察
1. 取材及前处理：取健康小白鼠（约65-90天龄）， 腹腔注射0.1%秋水仙素溶液0.1ml，剂量为 4ml/Kg动物体重 2. 取骨髓：将已用秋水仙素前处理的小白鼠，经过 2-3小时后，用损伤脊椎法处死小白鼠，立即取出 两侧股骨，把肌肉刮净，然后从骨股两端关节处 剪下，用2%柠蒙酸钠溶液洗净骨股上的血污及肌 肉残渣，剪去骨股两端膨大的关节头，使其露出 骨髓，然后用吸有3-5ml2%柠檬酸钠溶液的注射 器，从股骨的一端插入针头，往骨髓内冲洗多次， 直至股骨断面变成粉白色为止，可多剪几个断面 反复冲洗，这样制备了骨髓细胞悬浮液，也可用 眼科镊子小心地取出骨髓，置于有少量柠檬酸钠 溶液培养皿中捣碎，然后再加入2%柠檬酸钠溶液 适量，制成3-5ml骨髓细胞悬液
骨髓细胞染色体的制备与观察
2010级生物技术专业——冯德
实验目的 实验原理
实验用品 实验方法
实验目的
初步掌握小白鼠骨随细胞染色体的制 备方法，计算骨髓细胞分裂中期的分裂相 的染色体数目并观察端着丝点的形态特 点．
实验原理
小鼠骨髓细胞中的造血干细胞能生成 各种血细胞和原始细胞，具有较高的分裂 能力。本实验采用这一材料，通过前处理， 低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色 体标本，可观察到许多处于分裂中期的染 色体
3.
பைடு நூலகம்1.
低渗处理：用吸管将骨髓细胞悬液移入带刻度离心管 内，1000rpm离心10分钟，吸去上清液。加入0.075M氯 化钾溶液5ml立即将细胞团吹打均匀，置37℃水浴25-30 分钟 4. 预固定、固定：经低渗处理后的细胞，加入卡诺氏 固定液5-6滴搅拌均匀进行预固定10分钟，然后以 1000rpm离心10分钟，此为第一次固定然后以同法离心， 弃上清液，仅留约0.2-0.3ml的细胞团与部分上清液，吹 均匀制成细胞悬浮液涂片观察。如果细胞分散的不好， 可再按上述方法再固定1-2次，使染色体进一步分散 气干法制片：取预先冰冻的载玻片，滴2-3滴细胞 悬浮液于其上，立即吹气均匀打散、过火、置室温中自 然干燥

3.药品： 0.15mg/ml 秋水仙素， 1%柠檬酸三钠，固定液（3 份甲醇，1 份冰
乙酸，临用时现配），Giemsa 染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M 磷酸缓冲液（PBS）pH6.8。 实验准备 溶液配制：
(1) 2.2%柠檬酸三钠：称 11g 柠檬酸三钠到 500ml 蒸馏水中，充分溶解； (2) 1%柠檬酸三钠：取 5g 柠檬酸三钠溶解到 500ml 蒸馏水中，充分溶解； (3) PBS（pH6.8): A 液：取 Na2HPO4 12g 溶于 500ml 蒸水中，充分溶解；
38 44 45 40 36 41 43 39
表 2 对苯二酚对动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率
组别
剂量
动物数 受检细胞数 含微核细胞数 微核率
P值
(g/kg 体重)
(只)
(个)
(个)
(‰)
受试物 120
的核块，而在细胞浆中形成 1 个或数个独立于主核、直径小于主核的 1/3、染色与 主核一致但比主核淡的核小体，因比主核小，故称为微核。微核率的大小与作用因 子的剂量或辐射累积效应呈正相关。
6.凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核 试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正 常核难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个 阶段，此时红细胞的主核已被排出，因胞质内含有核糖体，Giemsa 染色后呈灰蓝色， 成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微 核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选 细胞群。
判断制片优劣的标准，观察时选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区 域镜检，由低倍镜到高倍镜，并按一定顺序镜检； ⑥此次实验用于制片透明的二甲苯为有毒物质，在透明的过程中要即使将盖子盖 好，注意不要将其泼洒在实验桌或者沾到皮肤，若出现池中情况应该及时用自来 水冲洗； ⑦最后在将涂片制成永久封片时，用注意所用的光学树脂胶应适量，过多容易使树 胶溢出而容易沾在盖玻片表面而使制片清晰度下降，影响观察； ⑧注意微核与颗粒异物、嗜多染红细胞与其他骨髓细胞不同阶段血细胞的区分。

内容与方法
1、动物预处理：取材前 3~4小时，腹腔注射 0.01%的秋水仙素。
2、取材：处死小白鼠，剥取股 骨，暴露骨髓腔，用4~5ml KCl 冲洗骨髓腔获得骨髓细胞，定容 至6ml。
4、预固定：加1mlCarnoy 固定液混匀，配平，离心 1000rpm/8分钟。
3、低渗：37度恒温水浴30分钟 ➢在酒精灯火焰过火2~3次， ➢做记号，凉干，染色
作业与思考题
1、绘制一个你所观察到的小鼠骨髓细胞 染色体中期分裂相。
2、本实验中秋水仙素、低渗液、固定液 各起什么作用？
3、简述实验中应注意那些关键问题？
目的与要求
1、掌握脊椎动物骨髓细胞染色体标本制备的 方法；
2、了解小鼠骨髓细胞染色体的形态和数目。
实验原理
➢ 小鼠骨髓细胞始终保持较强的分裂活性，且细胞 数量较多。
➢ 秋水仙素，可以抑制细胞分裂时的纺锤体形成，使处于 增殖状态的细胞停止在中期。注射到动物活体内，可以 收集到较多的中期分裂相的骨髓细胞。
5、固定：弃上清，再加 Carnoy 固定液至6ml刻度， 悬浮，静置20分钟，离心 同上。
6、制片：去上清液,加少量固定液， 混匀，滴片，
7、染色：Giemsa染色10分钟
取材：椎脱臼处死小白鼠，剥取股骨。
小白鼠骨骼标本
收集细胞：
➢ 暴露骨髓腔，
➢ 反复冲洗骨髓腔获得 骨髓细胞，
➢ 收集到离心管中,

可见中西医学，一个是以“功能人” 为概念 的独特 的哲学 医学理 论体系 ，一个 是以“ 解剖人 、肉体 人”为 概念的 新兴的 现代医 学科学 理论体 系，二 者都不 是以完 整人为 研究对 象的科 学，从 理论讲 二者都 不是科 学的， 势必影 响各自 发展。 事实也 证明这 一切， 中医长 期停滞 不前、 疗效也 不确实 。西医 尽管发 展到目 前的基 因分子 层次， 但疾病 发病率 居高不 下，对 绝大部 分疾病 发病原 因认识 不清、 发病机 理弄不 明白， 治疗受 到制约 ，在小 小SAR S、禽 流感面 前竟束 手无策 ，在糖 尿病、 癌症、 心脑血 管疾病 、尿毒 症等相 当多疾 病面前 更是不 得不求 助或借 助中医 治疗。 一个是 疗效不 确实， 一个是 有些甚 至相当 多疾病 无法治 疗，这 就是中 西医学 结合的 缘由。 然而， 由于二 者是两 套理论 、两股 道上跑 的车， 风马牛 不相及 ，从理 论上讲 就没有 结合的 可能， 只是形 式上的 融合罢 了。故 出现西 医对治 疗不了 的疾病 只好求 助中医 ，而中 医则往 往采用 西医诊 断中医 治疗， 以及中 西治疗 法一块 用的局 面。
遗传学实验
小鼠骨髓细胞染色体标本 制作与观察
实验目的 实验原理 实验用品 实验步骤 绘图 思考题
实验目的
掌握动物骨髓染色体标本制备基 本程，了解操作步骤的原理
实验原理
小鼠骨髓细胞中的造血干细胞是 生成各种血细胞和原始细胞，具有高 度的分裂能力，本实验采用这一材料， 通过前处理，低渗，固定，制片，染 色等步骤制得染色体标本，可观察到 许多处于分裂中期的染色体，可以进 行染色体组型分析。
实验用品
1．材料：小白鼠 2．器具：注射器（1ml,5ml） 剪刀 镊子

三、实验材料
（一）材料昆明种小白鼠若干只。
（二）器材水平离心机、显微镜、刻度离心管(10m1、注射器(1m1、载玻片、烧杯(400m1、100m1、试管架、镊子、剪刀、解剖刀、吸管、擦镜纸。
（三）试剂
1. 2％柠檬酸钠溶液：称取28g柠檬酸钠(柠檬酸三钠，Trisodium citrate，AR溶解于蒸馏水中。
5. 0.067mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8
Na 2HPO 4. 12H2O 11.81g
(或Na 2HPO 4. 2H2O 5.92g
KH 2P04 4.5g
溶解于蒸馏水中至1000m1。
6.姬姆萨(Giemsa应用液(pH6.8
取1ml姬姆萨原液用9ml 0.067mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8稀释即可。当天临时配制，一天后失效。
2.由于小鼠的股骨较细，因此应细心地剥去皮肤，然后用手术剪剪去两端骨骺，用装有2％柠檬酸钠溶液的注射器针小心插入骨髓腔将溶液注射完毕，并反复从两端冲洗将骨髓冲出来，吹洗直至骨腔变白。此外要防止注射针头阻塞。
3.低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失。低渗处理时间不足，细胞内染色
5.滴片固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。在干净、冰冷的载玻片上滴2～3滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干，在空气干燥30min。
6.染色将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加1：10 Giemsa应用液0.2～1m1，染色10min。
七、作业
1.记录所观察小白鼠骨髓细胞染色体的数目和形态。
2.如果在实验前不给小鼠腹腔注射秋水仙素，所制备的染色体标本会出现怎样

9．在干净、湿冷的载玻片上以高距离滴2～3 滴上层细胞悬液，气干或在酒精灯上文火 烘干。注意在滴片时要有一定的高度（大 于40cm），使细胞膜破裂后易于使染色体 散开，并尽量使滴片上的细胞分布均匀， 不要重叠。
10．气干，染色。 在一块洁净的玻板上，将玻片标本有细胞的一面 朝下用牙签架空于玻板上。 11．用滴管将配好的染液充满于玻板与载玻片之间 的空隙中，注意载片上有细胞面的进行染色并在 滴加染液时注意排除气泡。视室温而定，染色15 分钟。 12．染色后，轻轻揭起玻片，倾斜玻片在自来水管 下细水流冲洗数秒，冲掉染液，擦干玻片标本底 面和四周，显微镜观察和分析。注意不要搞错沾 有细胞的一面。选择染色较好、较分散、形态清 晰的细胞分裂相，进行显微观察。
小鼠骨髓细胞染色体 标本的制备与观察
实验目的：
1．初步掌握动物骨髓细胞染色体的制备方法。 2．了解小鼠骨髓细胞染色体的形态特点。Fra bibliotek实验原理：
染色体是细胞分裂时期遗传物质存在的特定 形式，是染色质紧密包装的结果。染色体 是有机体遗传信息的载体，对染色体的研 究在生物进化、发育、遗传和变异中有十 分重要的作用。
谢 谢 大 家
核型分析均是以中期染色体为标准，对制 作出的染色体标本进行照相以获得染色体 的显微图像，并将其剪裁排列即成，或用 专用软件进行分析排列。 凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各 种处理后，细胞就可进入分裂期此时均可 用于染色体分析。
在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的 组织之一。此时给动物注射一定剂量的秋 水仙素可使许多处于分裂的细胞停滞于中 期（ 秋水仙素可阻断纺锤丝微管的组装）， 然后采用常规空气干燥法制备染色体，即 可得到大量可供分析的染色体标本。本方 法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌 操作。

6．加Giemsa染液染色8－10min，流水冲去 染液（注意水流不可急，细流冲去即可）， 干燥（晾干），观察，可见分散良好的染 色体。
小白鼠的保定和注射
五．结果与讨论
1．结果： （1）．选取分散良好的染色体绘实物图，上 传图片1幅）。 （2）．染色体计数（2n=40）。 2．讨论： （1）．实验前注射秋水仙素的作用？不作此 步会怎样？ （2）．为何要用冷冻片？烘烤片的作用？
小鼠骨髓细胞染色体
试验六 小白鼠骨髓细胞染色 体制备及观察
一．实验目的：
1．学习小鼠骨髓细胞染色体制备方法。
2．观察骨髓细胞染色体，计数染色体。
二．原理：
活跃增值的组织细胞内染色体可用于制片分 析，秋水仙素（或以对二氯苯代之）可使 细胞分裂停滞于分裂中期，经染色处理， 可得到清晰的中期染色体标本。
三．材料试剂
1．材料：小白鼠；ห้องสมุดไป่ตู้
2．试剂：Giemsa染色液，0.4％KCl，2％柠 檬酸钠，固定液（甲醇：冰乙酸＝3：1）。
四．操作步骤
1．实验前4－8h小鼠腹腔注射秋水仙素1ml （0.14mg/ml）,(据小鼠体重用量调整)或1ml饱和 对二氯苯。 • 2．脱臼处死小鼠，取后肢胫骨和股骨，去两端。 用细针头注射器吸取2％柠檬酸钠1ml，反复冲洗 骨髓腔5次，将冲洗液（离心管中）加入0.4%KCl 低渗10min（8ml,37℃）。
• 3．离心（1000rpm，8min）,去上清液，加固定 液5ml（注意缓慢加入）。充分吹打，使沉淀块 分散，静置10min，再离心10min，弃上清液， 重复一次。
4．用约2ml固定液悬浮骨髓细胞成悬液（依 沉淀量定）。
5．取冷冻载片，距载片15cm高度滴下悬液 （取悬液前吸打均匀），单向吹气展开， 酒精灯上文火烘干。

授课重点
小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和制备方法，小鼠骨髓细胞染色体的基本特征。
授课难点
小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和制备方法。
授课形式
小班实验教学，分组操作
授课方法
查阅资料和预实验；板书、板图和PPT，口头讲述，操作示范，针对性辅导。
参考文献
1.翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学.高等教育出版社，2011
2.李虹.医学生物学与医学细胞生物学.科学出版社，2007
3.杨保胜，李晓文.医学形态学实验指导—细胞生物学与遗传学分册.人民卫生出版社，2005
4.张光谋，李延兰.医学细胞生物学实验技术.科学出版社，2013
思考题
1.简述小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和操作过程。
2.绘制小鼠骨髓染色体核型示意图。
新乡医学院教案首页
课程名称
医学细胞生物学实验
授课题目
小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察
授课对象
生物医学各专业一年级本专科生
时间分配
讲解本次实验的目的、原理、方法、注意事项及作业30分钟；学生操作与辅导150分钟；总结20分钟。
课时目标
掌握小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和方法，掌握小鼠骨髓细胞染色体的基本特征。
5.实验动物：3月龄左右小鼠一只。
6.试剂：
(1)100μg/ml秋水仙素：秋水仙素5mg，加5ml灭菌的生理盐水，即成1mg/ml秋水仙素溶液，于冰箱中闭光保存备用，使用时可用生理盐水稀释到100μg/ml固定液；
(2)固定液：甲醇：冰醋酸=3：1（时间过长会产生沉淀，现配现用）；
(3)低渗液：0.075mol/L KCl（提前37℃预热）；
3．低渗：将离心管置37℃恒温水浴箱中，低渗30 min后取出，使细胞充分吸水膨胀。低渗不好则在制片时细胞不易破裂，染色体不易分散开。

u 预固定：终止低渗作用，使细胞离心时不易破裂， 固定维持细胞形态结构。
u 高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体 标本，在显微镜下观察染色体的结构和数量。
三、实验器材和试剂
1、器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射
器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试 管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、香波油、 乙醚酒精、擦镜纸
滴1～2滴，用口顺着倾斜面吹散源自胞，迅速过火焰3-5次进行干燥。 注意：a. 温度、高度、倾斜度 b. 火焰干燥的目的：使固定液迅速挥发，产生四周张力加速
细胞破裂，使染色体更好地粘连在载玻片上；不可使载玻片烫手。
7.染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，染色8～10min，倒去染
液，用自来水缓缓冲洗干净、晾干。（染色盘中进行） 注意：采用平铺的方法
21三体综合征； 18三体综合征、 猫叫综合征
18三体综合征
二、实验原理
染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊 断中。例如白血病、恶性血液病等的诊断。
染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。 细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，
是染色体观察的最佳时期。
骨髓细胞 数量多且分裂旺盛，可直接进行染色体 标本的制备。取材方便，操作简单和无需体外培养 和无菌操作，是研究小型哺乳动物等染色体的常用 方法。
作用：终止低渗；维持细胞的膨胀状态；防止离心破裂
5. 固定、制细胞悬液：加固定液5ml 吹打混匀 固定15min 离心1500r/min，5min 弃上清，加固定液 0.2~0.4ml 吹打成细胞悬液，准备制片使用。
制备细胞悬液时，根据具体情况加固定液，以悬液呈现 乳白色为宜。
6. 滴片：冰片倾斜30°, 细胞悬液距离玻片15-30cm高，在不重叠位置