苯酚硫酸法测定多糖含量

实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。

2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。

6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。

实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1.目的要求测量蔥酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品屮的多糖含量2•方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3•主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馆装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

5 .试剂配制1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馅水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馆水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。

2)90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL,蒸憎水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶屮避光保存3)6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%,即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。

6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤0123456AvV丨• ■ •葡萄糖0. 00. 10. 20. 30.40. 60. 8 1.0苯酚液0. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 5浓硫酸 3. 0 3. 0 3. 0 3. 0 3.0 3. 0 3. 0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n,取出凉水冷却lOmin,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处(490nm)测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

用exceL软件求得回归方程2)待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馅水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。

苯酚硫酸法是测定多糖的常用方法
该测定方法的基本原理是多糖在浓硫酸作用下水解成单糖并迅速脱水生成糠醛衍生物随后与苯酚结合生成有色化合物从而可以利用分光光度计测定其吸光度并利用标准曲线定量测定样品中的多糖含量。

1 . 5 葡萄糖标准曲线的绘制
称取烘至恒重的无水葡萄糖3.324 g, 溶于
1 000 mL 重蒸水中, 配成3.324 g/L 的标准溶液,
然后将标准溶液分别稀释成质量浓度为33.24 、
66.48 、99.72 、132.96 、166.20 和199.44 μg/mL 的溶
液。

取该溶液各0.2 mL 置于10 mL 具塞试管中,
加入50 g/L 苯酚溶液0.4 mL, 旋涡混合均匀后迅
速加入2.0 mL 浓硫酸, 再旋涡混合均匀后室温放
置30 min , 在波长490 nm 处测定其吸光度, 用蒸
馏水代替葡萄糖溶液作空白对照。

以吸光度为纵
坐标, 糖的浓度为横坐标作标准曲线。

线性回归方
程为: Y = 0.0039C + 0.0033 ( Y: 吸光度; C: 浓度; r =
0.9997 ) 。

硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖是一种常用的多糖测定方法，其原理基于多糖与硫酸苯酚反应产生显色化合物的特性。

在测定中，首先将待测样品中的多糖加入到试管中。

然后，向试管中逐渐加入浓硫酸，并快速而彻底地混合。

硫酸的加入会引发多糖与硫酸之间的酸水解反应，生成大量的醛基。

随后，加入苯酚试剂，苯酚与醛基反应生成的有色化合物会根据多糖的种类和含量而呈现出不同的颜色。

颜色的深浅可以通过分光光度计进行测量，从而得到多糖样品中多糖含量的定量结果。

该方法的优点是简单、快速，且对多糖具有较好的选择性。

然而，需要注意的是，在进行测定时应严格控制硫酸和苯酚试剂的加入量和混合程度，以避免反应过程中的误差产生。

总结起来，硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，通过多糖与硫酸和苯酚的反应生成有色化合物来实现多糖的测量。

随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。

目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。

该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。

１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。

其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。

２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。

２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。

精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。

２．４　测定条件选择２．４．１　反应温度选择　精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。

分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。

一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。

另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。

取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。

２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择　分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。

一、总糖含量标准曲线的绘制
准确称取无水葡萄糖10 mg，溶解后转入100 mL容量瓶定容。

按表4所示操作。

表4 总糖含量标准曲线绘制方法
管号0 1 2 3 4 5
标准葡萄
糖溶液
（mL）
0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8
蒸馏水
（mL）
2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 6%苯酚各1.0 mL
浓硫酸各5.0 mL
检测
摇匀后沸水加热10 min，冷却至室温后于490 nm处以0号管为空白对照，测光密度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线：Y=aX+b（Y为吸光值,X为葡萄糖质量/ug）。

二、试液总糖含量的测定
用移液枪从总体积V中吸取一定体积V1ml的待测液，用蒸馏水补至体积为2 mL，加入6%苯酚1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，空白对照以蒸馏水代替待测液，摇匀后沸水加热10 min，冷却后，在490 nm处测定吸光值为A。

查标准曲线，算出总糖含量。

m(g)=V(A−b)/a
1000000V1。

硫酸苯酚法测多糖原理硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法。

它基于多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物的原理。

本文将详细介绍硫酸苯酚法的测定原理及操作步骤。

一、原理多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物，同时伴随着苯酚的生成。

苯酚在测定中以红色产物的形式存在，其吸光度与多糖的含量成正比。

因此，通过测定红色产物的吸光度，就可以确定多糖的含量。

二、操作步骤1. 样品处理：将待测的多糖样品溶解于适量的水中，并进行适当的稀释，使得多糖浓度在硫酸苯酚法的线性范围内。

确保样品中没有其他干扰物质的存在。

2. 反应体制：将样品溶液与硫酸苯酚试剂混合，加入适量的浓硫酸，混匀后放置于水浴中加热。

加热时间一般为5-10分钟，加热温度为100-110摄氏度。

3. 冷却与测定：将反应体系冷却至室温后，使用紫外可见光谱仪或分光光度计测量红色产物的吸光度。

根据预先建立的标准曲线，可以计算出多糖的含量。

三、注意事项1. 操作过程中要注意安全，避免与浓硫酸直接接触，避免产生有毒气体。

2. 硫酸苯酚试剂需保存在避光的环境中，避免暴露于阳光下。

3. 加热过程中要控制温度，避免过高温度导致产物分解。

4. 测定前要校准光谱仪或分光光度计，确保准确测量吸光度。

四、优缺点硫酸苯酚法作为一种测定多糖含量的方法，具有以下优点：1. 简单易行：只需准备少量试剂和仪器设备，操作简便。

2. 灵敏度高：对于大多数多糖具有较高的灵敏度，可以检测到低浓度的多糖。

3. 可靠性好：经过多次验证，该方法的准确性和可重复性较高。

然而，硫酸苯酚法也存在一些局限性：1. 只适用于含有醛基的多糖：该方法只对具有醛基的多糖有效，对于其他类型的多糖则不适用。

2. 反应条件严格：反应温度和时间需要严格控制，否则会影响测定结果的准确性。

3. 有干扰物：一些其他物质可能与硫酸苯酚反应产生类似红色产物，从而干扰多糖的测定。

硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，其原理基于多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物的特性。

一、硫酸苯酚法测多糖含量1、试剂配制1. 浓硫酸：分析纯，95.5%2. 5%苯酚：取苯酚5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。

3. 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。

准确称取20m g经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。

2、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入5%苯酚1ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

1 2 3 4 5 6 7 8 00.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 标准葡萄糖溶液（mL）蒸馏水（mL）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5葡萄糖标准曲线y = 54.353x + 0.0018R 2 = 0.999400.10.20.300.0010.0020.0030.0040.0050.006葡萄糖浓度（mg/ml）吸光值3 注意事项（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg 数。

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算（4）测定时根据光密度值确定取样的量。

光密度值最好在0.1——0.3之间。

随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。

目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。

该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。

１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。

其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。

２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。

２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。

精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。

２．４　测定条件选择２．４．１　反应温度选择　精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。

分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。

一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。

另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。

取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。

２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择　分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。

实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1.目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2.方法原理糖在浓硫酸作用下,水解生成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚缩合成橙黄色化合物,且颜色稳定,在波长490 nm处和一定的浓度范围内,其吸光度与多糖含量呈线性关系正比,从而可以利用分光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量,本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3.主要实验仪器及材料浓硫酸,苯酚,蒸馏装置,分光光度计,电子天平,坐标纸或电脑等。

4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作,单糖到多糖的转换系数。

5.试剂配制1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液,摇匀后准确吸取10 mL该溶液,蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100ug/mL的葡萄糖标准液。

2)90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL,蒸馏水定容至100 mL,即得90%苯酚液,棕色瓶中避光保存3)6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%,即一体积储存液对应十四体积纯水,临用现配。

6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作,先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液,震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸,以不放热或微量放热为宜,摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处(490nm)测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标,从而来绘制标准曲线。

用exceL软件求得回归方程2)待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解,定容至100 mL,取溶解后的溶液,按标准曲线中的测定方法,以样液为参比液,测定溶液的吸光值,按回归方程计算待测溶液的多糖浓度,注意乘换算系数。