苯酚-硫酸法测定多糖的含量

实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。

2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。

6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。

苯酚硫酸法是测定多糖的常用方法
该测定方法的基本原理是多糖在浓硫酸作用下水解成单糖并迅速脱水生成糠醛衍生物随后与苯酚结合生成有色化合物从而可以利用分光光度计测定其吸光度并利用标准曲线定量测定样品中的多糖含量。

1 . 5 葡萄糖标准曲线的绘制
称取烘至恒重的无水葡萄糖3.324 g, 溶于
1 000 mL 重蒸水中, 配成3.324 g/L 的标准溶液,
然后将标准溶液分别稀释成质量浓度为33.24 、
66.48 、99.72 、132.96 、166.20 和199.44 μg/mL 的溶
液。

取该溶液各0.2 mL 置于10 mL 具塞试管中,
加入50 g/L 苯酚溶液0.4 mL, 旋涡混合均匀后迅
速加入2.0 mL 浓硫酸, 再旋涡混合均匀后室温放
置30 min , 在波长490 nm 处测定其吸光度, 用蒸
馏水代替葡萄糖溶液作空白对照。

以吸光度为纵
坐标, 糖的浓度为横坐标作标准曲线。

线性回归方
程为: Y = 0.0039C + 0.0033 ( Y: 吸光度; C: 浓度; r =
0.9997 ) 。

苯酚-硫酸法测多糖含量一、原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。

再以比色法测定。

二、试剂1、浓硫酸：分析纯，95.5%2、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3、6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。

（每次测定均需现配）4、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。

5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7、6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8、6mol/L 盐酸三、操作1、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2、样品含量测定1）取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。

最后一次将残渣一起到入离心管。

注意：总的溶液不要超出10毫升。

（既不要超出离心管的容量）。

2）离心，转速3000转/分钟，共三次。

第一次15分钟，取上清液。

后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。

最后滤液保持18毫升左右。

3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

4）定容取样。

水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。

定容至25毫升的容量瓶中。

苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸法是常用的多糖含量测定方法之一。

该方法基于多糖在硫酸的作用下，与苯酚产生颜色反应的原理，利用光度计测定反应产物的吸收值，从而计算出多糖的含量。

步骤如下：
1. 取样品0.1g，在50ml锥形瓶中加入5ml去离子水，振荡
20min溶解。

2. 加入2ml 5%苯酚水溶液，振荡均匀。

3. 加入5ml浓硫酸，使用磁力搅拌器搅拌1-2min。

4. 将混合物放置在冷水中冷却10min。

5. 用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度A，同时以含有相同试验液体积的去离子水为对照。

6. 计算样品中多糖含量。

该方法测定简便，精度高，适用于多糖含量较高的样品。

但此法不能区分多糖的种类及其组成，不能应用于含非多糖的样品中。

多糖含量的测定3,5-二硝基水杨粗多糖中的总糖含量使用苯酚-硫酸法进行测定，还原糖用酸（DNS）法测定，多糖含量=总糖-还原糖。

1、总糖含量测定实验原理：多糖在硫酸作用下，先水解成单糖，并脱水生成糖醛衍生物，与苯酚生成橙黄色溶液，在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

试剂：浓硫酸（分析纯）、5%苯酚溶液（分析纯）、标准葡萄糖。

操作步骤：①制作标准曲线：准确称取105 C烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1 mg/ml的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/ml。

1 ml标准液分别加入5%苯酚溶液1 ml，并迅速加入浓硫酸5 ml，静置10 min。

摇匀，30 °C放置30 min后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。

②样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。

2、还原糖含量实验原理碱性条件下，DNS可与还原糖反应生成3-氨基-5-硝基水杨酸。

此物质在煮沸条件下成棕红色，且颜色深浅在一定范围内与还原糖含量成线性关系。

据此可通过测定OD值确定还原糖含量。

试剂及配制：浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液。

DNS显色液：称取3.25g DNS溶于少量蒸馏水中并转移至500ml容量瓶中，加入2mol/L的NaOH溶液162.5ml，再加入7.5ml的丙三醇，摇匀，加蒸馏水定容至500ml，摇匀。

操作步骤① 标准曲线制作：在6支试管中分别加入1mg/ml葡萄糖标准溶液0.00ml，0.10ml，0.20ml，0.30ml，0.40ml，0.50ml，补蒸馏水至0.5ml，然后加入DNS 试剂1.5ml，充分混匀。

置于沸水浴中煮沸5mi n,然后迅速流水冷却，并分别向试管中加入4ml蒸馏水，混匀。

在540nm处读0D值。

多糖浓度测定及标准曲线谭夕东苯酚-硫酸法1. 对照品的溶液的制备取干燥至恒重的无水葡萄糖0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

供试品的溶液的制备精密量取本品50ml，置250ml量瓶中，加30%硫酸锌溶液5ml，在水浴中加热5分钟后，在振摇下立即加入亚铁氰化钾试液5ml，冷却后加水至刻度，摇匀，滤过，弃取初滤液，取续滤液25ml，置500ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

测定方法精密量取对照品溶液与供试品溶液各2ml，分别置10ml量瓶中，各加2%苯酚溶液0.5ml，硫酸5ml，摇匀，置水浴中加热15分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法测定。

2.标准曲线的绘制：精密称取千燥恒重的葡萄糖100mg，用水溶解并稀释至100ml，备用。

精密吸取备用液10ml加水稀释至100ml定容，得葡萄糖标准液。

精密吸取标准液100、200、…700微升，分别置于试管内，各加水使成2ml，再各加5%苯酚试剂1.0ml，各管迅速滴加浓硫酸5.0ml，立刻摇匀。

沸水加热15分钟，迅速冷却，另取2ml水，同法操作加入试剂作空白对照．用紫外可见分光光度计在入=490nm测定吸光度。

以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程海藻酸钠样品1g,用100mL蒸馏水溶解并定容。

壳聚糖溶液的配制：①先将50mL冰醋酸溶于1000mL的蒸馏水中制成5%的乙酸水溶液1000mL待用。

②称取壳聚糖5g溶于500mL5%的乙酸水溶液中配成10g/L的壳聚糖乙酸溶液。

或精密称取壳聚糖40 mg于100 mL量瓶中，用0. 5 mol·L-1’醋酸溶解并定容。

几丁质不溶于水、稀酸、稀碱及绝大部分溶剂中，据目前所知，几丁质仅能溶于少数溶剂，如六氟异丙酮，六氟丙酮水合物、吡咯烷酮的氯化锂溶液，一些氯醇和浓酸等。

1。

随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。

目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。

该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。

１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。

其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。

２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。

２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。

精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。

２．４　测定条件选择２．４．１　反应温度选择　精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。

分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。

一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。

另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。

取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。

２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择　分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。

一、总糖含量标准曲线的绘制
准确称取无水葡萄糖10 mg，溶解后转入100 mL容量瓶定容。

按表4所示操作。

表4 总糖含量标准曲线绘制方法
管号0 1 2 3 4 5
标准葡萄
糖溶液
（mL）
0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8
蒸馏水
（mL）
2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 6%苯酚各1.0 mL
浓硫酸各5.0 mL
检测
摇匀后沸水加热10 min，冷却至室温后于490 nm处以0号管为空白对照，测光密度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线：Y=aX+b（Y为吸光值,X为葡萄糖质量/ug）。

二、试液总糖含量的测定
用移液枪从总体积V中吸取一定体积V1ml的待测液，用蒸馏水补至体积为2 mL，加入6%苯酚1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，空白对照以蒸馏水代替待测液，摇匀后沸水加热10 min，冷却后，在490 nm处测定吸光值为A。

查标准曲线，算出总糖含量。

m(g)=V(A−b)/a
1000000V1。

硫酸苯酚法测多糖原理硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法。

它基于多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物的原理。

本文将详细介绍硫酸苯酚法的测定原理及操作步骤。

一、原理多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物，同时伴随着苯酚的生成。

苯酚在测定中以红色产物的形式存在，其吸光度与多糖的含量成正比。

因此，通过测定红色产物的吸光度，就可以确定多糖的含量。

二、操作步骤1. 样品处理：将待测的多糖样品溶解于适量的水中，并进行适当的稀释，使得多糖浓度在硫酸苯酚法的线性范围内。

确保样品中没有其他干扰物质的存在。

2. 反应体制：将样品溶液与硫酸苯酚试剂混合，加入适量的浓硫酸，混匀后放置于水浴中加热。

加热时间一般为5-10分钟，加热温度为100-110摄氏度。

3. 冷却与测定：将反应体系冷却至室温后，使用紫外可见光谱仪或分光光度计测量红色产物的吸光度。

根据预先建立的标准曲线，可以计算出多糖的含量。

三、注意事项1. 操作过程中要注意安全，避免与浓硫酸直接接触，避免产生有毒气体。

2. 硫酸苯酚试剂需保存在避光的环境中，避免暴露于阳光下。

3. 加热过程中要控制温度，避免过高温度导致产物分解。

4. 测定前要校准光谱仪或分光光度计，确保准确测量吸光度。

四、优缺点硫酸苯酚法作为一种测定多糖含量的方法，具有以下优点：1. 简单易行：只需准备少量试剂和仪器设备，操作简便。

2. 灵敏度高：对于大多数多糖具有较高的灵敏度，可以检测到低浓度的多糖。

3. 可靠性好：经过多次验证，该方法的准确性和可重复性较高。

然而，硫酸苯酚法也存在一些局限性：1. 只适用于含有醛基的多糖：该方法只对具有醛基的多糖有效，对于其他类型的多糖则不适用。

2. 反应条件严格：反应温度和时间需要严格控制，否则会影响测定结果的准确性。

3. 有干扰物：一些其他物质可能与硫酸苯酚反应产生类似红色产物，从而干扰多糖的测定。

硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，其原理基于多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物的特性。

实验一硫酸苯酚法测多糖含量The pony was revised in January 2021实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求? 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．2．方法原理3．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

4．3．主要实验仪器及材料5．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

6．４．掌握要点7．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

8．５．试剂配制9．1）葡萄糖标准液的配制10．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。

11．2）90%苯酚液的配制12．?准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。

6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤7.管号 0? 1 2 3 4 5 6 78.葡萄糖9.10.苯酚液11.浓硫酸?12.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

用exceL 软件求得回归方程13.2）待测样品多糖的测定与计算14.将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。

苯酚-硫酸法测多糖含量原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。

再以比色法测定。

试剂1．浓硫酸：分析纯，95.5%2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。

（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8． 6mol/L 盐酸操作1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。

最后一次将残渣一起到入离心管。

注意：总的溶液不要超出10毫升。

（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。

第一次15分钟，取上清液。

后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。

最后滤液保持18毫升左右。

（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。

因为其脂肪含量大容易夹带残渣。

）③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

④定容取样。

水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。

实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1. 目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2•方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3•主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

5 .试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。

2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。

6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤AvV 口吕号0 1 2 3 4 5 6葡萄糖0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表 2方法在操作，先在冰水浴中加入 0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n, 取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

用 exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。

实验八硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求目前植物性功能多糖是食品化学领域研究的热点之一，本实验的目的是让学生掌握本方法，以及以单糖为标准建立的标准曲线在适用到多糖时添加转换系数的方法。

2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

５．实验步骤1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，用蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。

2）苯酚液的配制准确移取苯酚6 mL，蒸馏水定容至100 mL，即得6％苯酚液，棕色瓶中避光保存。

表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8苯酚液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0浓硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0取8支干净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5 min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

用exceL软件求得回归方程3）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。

1．1原理
多糖可以被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490nm处和一定浓度范围内，其吸光度值与糖含量呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

1．2实验步骤
1．2．1100μg/ml D-葡萄糖对照品溶液制备
精密称取10mg D-葡萄糖，加纯化水充分溶解，定容至100ml，作为对照品溶液。

1．2．26%苯酚溶液配制
称取6g苯酚，加入纯化水充分溶解，定容至100ml，备用。

1．2．3对照品管制备
取8支试管，按下表按下表加入100μg/ml D-葡萄糖对照品溶液：
1．2．4供试品管制备
将供试品采用纯化水稀释至D-葡萄糖标准曲线范围内，每步稀释应不超过10倍。

10倍及以内的稀释直接在玻璃试管中进行。

10倍稀释用移液器量取供试品100μl，加纯化水900μl，振荡混匀。

原倍稀释直接取供试品1.0ml加入玻璃试管中。

10倍以内稀释操作按下表在试管中加入相应溶液。

大于10倍的稀释需按下表操作在离心管中先做10倍或100倍稀释（2步10倍稀释）后，再在玻璃试管中按照下表量取稀释。

更高稀释倍数也按照上述原则进行。

1．2．5试验操作
向含有1ml标对照品和供试品的试管中加入0.6ml 6%苯酚溶液，混匀，迅速加入3ml浓硫酸，混匀，置沸水浴反应20分钟。

显色后，冷却至室温，依据紫外-可见分光光度计标准操。

一、硫酸苯酚法‎测多糖含量‎ 1、试剂配制1. 浓硫酸：分析纯，95.5%2. 5%苯酚：取苯酚5 g ，置100 ml 容量瓶‎中，加蒸馏水至‎刻度，摇匀后，置棕色试剂‎瓶中，冰箱中冷藏‎储存备用。

3. 标准葡聚糖‎（Dextr ‎a n,瑞典Pharm ‎a cia ）或分析纯葡‎萄糖。

准确称取2‎0m g 经105‎℃干燥至恒重‎的葡萄糖标‎准品于50‎0ml 容量‎瓶中，蒸馏水溶解‎定容。

2、制作标准曲‎线准确称取标‎准葡聚糖（或葡萄糖）10mg 于‎250ml ‎容量瓶中，加水至刻度‎，分别吸取0‎.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml ，各以蒸馏水‎补至1.0ml ，然后加入5‎%苯酚1ml ‎及浓硫酸5‎.0ml,摇匀冷却，室温放置2‎0min 以‎后于490‎n m 测光密‎度，以1.0ml 水按‎同样显色操‎作为空白，横坐标为多‎糖微克数，纵坐标为光‎密度值，得标准曲线‎。

12 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖‎溶液（mL ） 0.20.30.40.50.60.70.80.9蒸馏水（mL ） 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL ） 2.52.52.52.52.52.52.52.52.5葡萄糖标准曲线y = 54.353x + 0.0018R 2 = 0.999400.10.20.300.0010.0020.0030.0040.0050.006葡萄糖浓度（mg/ml）吸光值3 注意事项（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅‎制作一条标‎准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线‎宜用相应的‎标准多糖，如用葡萄糖‎，应以校正系‎数0.9校正μg ‎数。

（3）对杂多糖，分析结果可‎根据各单糖‎的组成比及‎主要组分单‎糖的标准曲‎线的校正系‎数加以校正‎计算（4）测定时根据‎光密度值确‎定取样的量‎。

硫酸－苯酚法测多‎糖含量1．目的要求测量蒽酮硫‎酸法不能测‎量的血清型‎的过程样品‎中的多糖含‎量，如1型。

2．方法原理糖在浓硫酸‎作用下，水解生成单‎糖，并迅速脱水‎生成糖醛衍‎生物，然后与苯酚‎缩合成橙黄‎色化合物，且颜色稳定‎，在波长49‎0 nm处和一‎定的浓度范‎围内，其吸光度与‎多糖含量呈‎线性关系正‎比，从而可以利‎用分光度计‎测定其吸光‎度，并利用标准‎曲线定量测‎定样品的多‎糖含量，本方法可用‎于多糖、单糖含量的‎测定。

3．主要实验仪‎器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计‎，电子天平，坐标纸或电‎脑等。

４．掌握要点硫酸显色的‎安全、准确操作，单糖到多糖‎的转换系数‎。

５．试剂配制1）葡萄糖标准‎液的配制准确称取干‎燥恒重的葡‎萄糖100‎mg，蒸馏水准确‎定容至10‎0 mL的1 mg/L的葡萄糖‎液，摇匀后准确‎吸取10 mL该溶液‎，用蒸馏水稀‎释定容至1‎00 mL,即得100‎ug/mL的葡萄‎糖标准液。

2）90%苯酚液的配‎制准确移取苯‎酚90mL‎，蒸馏水定容‎至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避‎光保存可达‎半年。

3）6%苯酚液的配‎制将90%苯酚液稀释‎至6%，即一体积储‎存液对应十‎四体积纯水‎，临用现配。

6. 实验步骤表1 标准曲线的‎制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净‎的具塞试管‎按表2方法‎在操作，先在冰水浴‎中加入0.5ml的苯‎酚溶液，震荡摇匀后‎缓慢逐滴加‎入纯硫酸，以不放热或‎微量放热为‎宜，摇匀后恒温‎加塞沸水放‎置20mi‎n,取出凉水冷‎却10mi‎n,以0号作为‎空白调零,在最大吸收‎波长处（490nm‎）测定吸光度‎。

苯酚-硫酸法测多‎糖含量一、原理多糖在硫酸‎的作用下先‎水解成单糖‎，并迅速脱水‎生成糖醛衍‎生物，然后与苯酚‎生成橙黄色‎化合物。

再以比色法‎测定。

二、试剂1、浓硫酸：分析纯，95.5%2、80%苯酚：80克苯酚‎（分析纯重蒸‎馏试剂）加20克水‎使之溶解，可置冰箱中‎避光长期储‎存。

3、6%苯酚：临用前以8‎0%苯酚配制。

（每次测定均‎需现配）4、标准葡聚糖‎（Dextr‎a n,瑞典Pharm‎a cia）或分析纯葡‎萄糖。

5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TC‎A加85克‎水使之溶解‎，可置冰箱中‎长期储存。

6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TC‎A加475‎克水使之溶‎解，可置冰箱中‎长期储存。

7、6mol/L 氢氧化钠：120克分‎析纯氢氧化‎钠溶于50‎0ml水。

8、6mol/L 盐酸三、操作1、制作标准曲‎线准确称取标‎准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于‎500ml‎容量瓶中，加水至刻度‎，分别吸取0‎.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水‎补至2.0ml，然后加入6‎%苯酚1.0ml及浓‎硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置2‎0分钟以后‎于490n‎m测光密度‎，以2.0ml水按‎同样显色操‎作为空白，横坐标为多‎糖微克数，纵坐标为光‎密度值，得标准曲线‎。

2、样品含量测‎定1）取样品1克‎（湿样）加1ml 15%TCA溶液‎研磨，再加少许5‎％TCA溶液‎研磨，倒上清液于‎10毫升离‎心管中，再加少许5‎％TCA溶液‎研磨，倒上清液，重复3次。

最后一次将‎残渣一起到‎入离心管。

注意：总的溶液不‎要超出10‎毫升。

（既不要超出‎离心管的容‎量）。

2）离心，转速300‎0转/分钟，共三次。

第一次15‎分钟，取上清液。

后两次各5‎分钟取上清‎液到25毫‎升锥形比色‎管中。

最后滤液保‎持18毫升‎左右。

3）水浴，在向比色管‎中加入2毫‎升6mol‎/L 盐酸之后摇‎匀，在96℃水浴锅中水‎浴2小时。

总多糖含量测定方法
总多糖的含量测定方法有多种，其中包括苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸比色法、蒽酮-硫酸法等。

1. 苯酚-硫酸法：苯酚-硫酸试剂可与游离的或多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm波长处、戊糖及糖醛酸在480nm 波长处有最大吸收，吸收度与糖含量呈线性关系。

2. 3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）：3，5-二硝基水杨酸与多糖水解后的还原糖生成有色物质进行测定。

这种方法是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。

3. 蒽酮-硫酸法：多糖与硫酸发生脱水反应，生成糠醛或其衍生物，与蒽酮试剂缩合生成有色物质进行测定。

此外，间羟基联苯法也是一种常用的多糖中糖醛酸含量测定方法，该法较硫酸咔唑法受中性糖残基的干扰更小。

另外还有超氧阴离子清除率和羟自由基清除率的检测方法、水分的检测方法等。

实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1.目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2.方法原理糖在浓硫酸作用下,水解生成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚缩合成橙黄色化合物,且颜色稳定,在波长490 nm处和一定的浓度范围内,其吸光度与多糖含量呈线性关系正比,从而可以利用分光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量,本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3.主要实验仪器及材料浓硫酸,苯酚,蒸馏装置,分光光度计,电子天平,坐标纸或电脑等。

4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作,单糖到多糖的转换系数。

5.试剂配制1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液,摇匀后准确吸取10 mL该溶液,蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100ug/mL的葡萄糖标准液。

2)90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL,蒸馏水定容至100 mL,即得90%苯酚液,棕色瓶中避光保存3)6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%,即一体积储存液对应十四体积纯水,临用现配。

6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作,先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液,震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸,以不放热或微量放热为宜,摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处(490nm)测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标,从而来绘制标准曲线。

用exceL软件求得回归方程2)待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解,定容至100 mL,取溶解后的溶液,按标准曲线中的测定方法,以样液为参比液,测定溶液的吸光值,按回归方程计算待测溶液的多糖浓度,注意乘换算系数。