小鼠胚胎心肌细胞的分离及电生理特性
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小鼠胚胎干细胞培养页数:6
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小鼠胚胎干细胞培养体系的建立页数:4
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昆明小鼠心室肌细胞分离方法及动作电位、L型钙通道电流记录
显著减轻二甲苯导致耳廓肿胀；显著抑制大鼠蛋 清性足跖肿胀；使溃疡面积显著减小，加快溃疡 愈合，明显改善受损组织病理变化；且相同剂量 不同品种间的作用无差异性，提示不同品种大黄 的抗炎、减轻局部炎症、改善皮肤受损，促进创 面肉芽及皮肤生长的作用一致。 对于外用中药促创面愈合的使用机理，中医 有“去腐生肌，煨脓长肉”之说 。是指在疮面愈 合的后期阶段，运用外敷中草药膏(散)，经皮肤和 创面对药物的吸收，促进局部的气血通畅，增强 其防御能力，使创口脓液渗出增多，载邪外出， 从而达到促进创面生长的目的。此法一是提脓祛 腐拔毒，增加局部脓液的渗出；二是渗出的脓液 有助于创面肉芽、皮肤的生长，祛腐生肌。在创 面愈合中期，此种脓液越多，则创面愈合越快。 又经查询中药功能 - 临床应用 - 药理作用数据库可 知治疗下肢溃疡内服功能主要是清热解毒、散结 止痛、活血消肿、敛疮生肌等。皮肤溃疡是中医 外科常见病、多发病，是以皮肤溃疡为主要临床 表现长期不能愈合为临床特征，皮肤组织缺损液 化坏死的一种体表疾病，本实验证明大黄油糊能 显著减少溃疡面积，加快溃疡愈合，提示大黄治 疗溃疡的关键在于收敛生肌。大黄外用也可用于 冻疮溃烂、化脓性中耳炎、烫伤、糖尿病并发下 肢溃疡、口腔溃疡等的治疗，这与大黄的外用收 敛生肌功能是一致的。本实验为临床皮肤溃疡提
收稿日期： 2012-02-21
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昆明小鼠心室肌细胞分离方法及动作电位、L 型钙通道电流记录
李映新 a，黄媛恒 b，林兴 c，黄仁彬 a*(广西医科大学，a.药学院；b.基础医学院实验生理学科学实验中心；c.医学科学实验中心，南
宁 530021)
摘要：目的
探讨耐钙昆明小鼠心室肌细胞的急性分离方法及动作电位、L 型钙通道电流的记录。方法
收稿日期： 2012-02-21
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昆明小鼠心室肌细胞分离方法及动作电位、L 型钙通道电流记录
李映新 a，黄媛恒 b，林兴 c，黄仁彬 a*(广西医科大学，a.药学院；b.基础医学院实验生理学科学实验中心；c.医学科学实验中心，南
宁 530021)
摘要：目的
探讨耐钙昆明小鼠心室肌细胞的急性分离方法及动作电位、L 型钙通道电流的记录。方法
小鼠原代心肌细胞分离
分离小鼠原代心肌细胞与大鼠原代细胞分离有所不同方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用PBS溶液（过滤灭菌）配制0.075%胰酶20mL备用（胰酶原液0.25%，6ml原液可以稀释至20ml）。
3、新生（1天）乳小鼠15-20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放PBS溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放PBS溶液，其二放1 mL0.075%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有PBS溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。
8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.075%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的149mL胰酶中4 ℃消化24h。
9、消化24h后，吸出11mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.05%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将18 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34-35 ℃左右，120 rpm。
10、配制两种培养液，DMEM-F12 10%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu（10 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F12 15%FBS中每20mL加67μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。
原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定
原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定＊程阔菊，黄河，杜智勇，李洪，杨天德△【摘要】目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法，评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。
方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏，台盼蓝染色判断心肌细胞存活率，α－actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。
结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞，台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%，α－actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。
结论严格控制实验条件，可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。
【期刊名称】重庆医学【年(卷),期】2013(000)022【总页数】3【关键词】乳小鼠；心肌细胞；分离；纯化；培养；鉴定各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。
体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，但由于小鼠心肌细胞的分离和培养比较困难，所以一直限制了医学科研工作者在细胞生物学水平上对心血管疾病方面的深入研究。
本实验室在以往的经验基础上，摸索出了一套成熟可行、简单可靠的小鼠心肌细胞培养方法，获得的心肌细胞存活率高且纯度高。
本文对此培养方法做一简单介绍，并对其中的关键影响因素做详细的探讨。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物1～3d龄野生型C57新生乳鼠，SPF级，由第三军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007－0003。
1.1.2 主要仪器与试剂显微眼用镊、眼科剪、显微镊、显微剪（上海医疗器械有限公司），器械使用前清洗干净并经高压灭菌（121℃，20min）。
二氧化碳培养箱、倒置显微镜（OLYMPUS）、超净工作台（苏净安泰）、低温台式离心机（Sigma）。
小牛血清、DMEM／F12、胰酶、胶原酶Ⅱ（GIBCO），BrdU－溴脱氧尿苷（Sigma），青霉素、链霉素（华美生物工程公司），anti－α－actinin（Millipore），组织固定液（Alphelys），Triton X－100（Amresco），SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen），Alexa goat anti－mouse IgG（H＋L）（Invitrogen）。
豚鼠心肌细胞分离方法及电生理特性的观察
豚鼠心肌细胞分离方法及电生理特性的观察宋建国;侯月梅【摘要】目的:建立膜片钳实验室单个心肌细胞的分离方法和膜片钳技术平台.方法:采用酶解法分离豚鼠心室肌细胞;在膜片钳全细胞模式下记录不同基础刺激周长时的动作电位以及L-型钙电流、延迟性整流钾电流.结果:酶解法分离豚鼠心室肌可以得到90%的存活细胞;豚鼠的单个心室肌细胞静息电位为(-74.0±2.2)mV,基础刺激周长1 000 ms时复极90%的动作电位时程(APD90)为(313.2±20.72) ms;APD90和复极50%的动作电位时程(APD50)均随着基础刺激周长的延长而延长.L-型钙电流峰值电流密度为(-7.36±1.10)pA/pF,0.1 mmol/L verapamil灌流后为(-1.22±0.49 )pA/pF,100 μmol/L CdCl2灌流后内向电流消失;延迟性整流钾电流密度为(4.88±0.96)pA/pF,2 μmol/L Dofetilide灌流后降低为(3.48±0.37)pA/pF.结论:酶解法分离的豚鼠心室肌细胞可以满足膜片钳实验的要求,此膜片钳技术可作为更深入电生理研究的平台.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2007(030)005【总页数】5页(P490-493,497)【关键词】膜片钳;单个心室肌细胞;动作电位;离子电流【作者】宋建国;侯月梅【作者单位】新疆医科大学第一附属医院心功能科,新疆,乌鲁木齐,830054;新疆医科大学第一附属医院心功能科,新疆,乌鲁木齐,830054【正文语种】中文【中图分类】R-332;R33膜片钳技术的成熟应用已经有20多年的历史，通过所谓的“膜片钳”的特殊电极，同时实现电压钳和电流钳的功能，通过对跨膜电压和电流的控制，既可以记录全细胞的宏电流，也可以监测单个通道的微观电流，达到研究离子通道乃至细胞的电生理特性的目的，是心脏电生理和生物膜特性研究中的一项重要的工具[1]。
心肌细胞的电生理特性
2．最大舒张电位水平 “4”时相舒张电位是自 动除极化而不断减小的电位，正常以其最大值为 标准，称为最大舒张电位。最大舒张电位减小(负 度)，则和阈电位的差距缩短，自律性增高；最大 舒张电位增大，达到阈电位所需时间增加，则自 律性降低。
3．阈电位水平 如果最大舒张电位和舒张期 自动除极化的速度不变，阈电位增高，则舒张除 极达到阈电位需要的时间延长，自律性降低；反 之，如阈电位水平降低(负度增大)，则从最大舒 张电位到达阈电位的差距缩小，自律性增高。
心脏内自律性最高的组织往往决定整个心脏的兴 奋节律，也即在正常情况下，窦房结自动地、有 节律地发出的兴奋向外扩散传导，依次兴奋心房、 房室交界区、房室束、束支、浦肯野纤维和心室 肌，引起整个心脏的收缩(搏动)。因此，窦房结 是心脏内发生兴奋和搏动的起点，称为心脏正常 的起搏点，其所形成的心脏节律称为窦性节律。
易颤期 在相对不应期的前半部分，心肌复极程度、兴奋 性和传导速度常有悬殊差别，处于电异步状态。在此期间 再给予刺激，容易发生多处的折返激动而引起颤动，故称 为易颤期或易损期。心房的易损期相当于R波的下降肢处， 心室的易颤期大致在T波的上升肢处。 超常期 在某些心肌细胞中，从-80mV到复极完毕的这 段期间内，兴奋性会高于该细胞动作电位的第“4”时相。 在这期间，给予阈下刺激也可引起心肌细胞兴奋，但其动 作电位的“0”时相除极化速度和幅度仍小于正常。超常期 (-80～－90mV)期间，膜电位比复极完毕更接近阈电位， 故引起兴奋所需的阈刺激较正常为小。超常期相当于心电 图中的T波末部的U波。
.1.心肌细胞自律性和各自律组织的相互关系 心脏内的特殊传导组织大都含自律细胞，为自律 组织。 自律组织包括：窦房结、心房传导组织(结间束和 房间束)、房室交界(房室结的结区除外)区和心室 内传导组织(房室束、束支及浦肯野纤维)。
成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定
成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定邓文文;赵然尊;龙仙萍;石蓓【摘要】目的建立稳定的小鼠心脏干细胞(cardiac stem cells,CSCs)分离方法,并对体外培养的CSCs进行生物学特性鉴定.方法选用健康成年CD1小鼠,在无菌条件下取心脏并剪碎,并用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶反复消化,采用差速离心法去除混合细胞悬液中的心肌细胞,结合免疫磁珠分选法纯化c-kit+ CSCs后,进行流式细胞仪表面标记鉴定.结果酶消化法和磁珠分选法结合成功分离并纯化了成年小鼠c-kit+ CSCs.磁珠分选前,流式细胞仪表面标记鉴定c-kit+ CD34-CSCs为4.62％;经磁珠分选后c-kit+ CD34-CSCs可达70.23％.结论酶消化法结合磁珠分选法能成功分离纯化成年小鼠c-kit+ CSCs,且能用于后续体外培养.体外培养时c-kit+ CSCs相对于其它表型标记的心脏干细胞更加稳定,具有较强的扩增能力.相对于心脏组织块培养法,酶消化法可在短期内获得高纯度的c-kit+ CSCs,更有助于心脏干细胞相关信号通道的体外实验研究.【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2013(036)005【总页数】5页(P406-409,412)【关键词】心脏干细胞;细胞分离;酶消化法;磁珠分选法;小鼠【作者】邓文文;赵然尊;龙仙萍;石蓓【作者单位】遵义医学院附属医院心血管内科,贵州遵义563099;遵义医学院附属医院心血管内科,贵州遵义563099;遵义医学院附属医院心血管内科,贵州遵义563099;遵义医学院附属医院心血管内科,贵州遵义563099【正文语种】中文【中图分类】R541在成年哺乳动物的心脏组织内，心脏干细胞数量较少，分离较为困难[1]。
而临床治疗需要大量的CSCs，这就使得CSCs的临床应用受到极大的限制。
迄今为止，CSCs的分离方法甚至不能完全满足CSCs的相关研究。
目前主要有两种方法用于分离鼠和人CSCs，一种是酶消化法[2]，另一种是原代组织贴壁培养法[3]。
小鼠原代心肌细胞分离
分离小鼠原代心肌细胞与大鼠原代细胞分离有所不同方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用PBS溶液（过滤灭菌）配制0.075%胰酶20mL备用（胰酶原液0.25%，6ml原液可以稀释至20ml）。
3、新生（1天）乳小鼠15-20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放PBS溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放PBS溶液，其二放1 mL0.075%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有PBS溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。
8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.075%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的149mL胰酶中4 ℃消化24h。
9、消化24h后，吸出11mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.05%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将18 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34-35 ℃左右，120 rpm。
10、配制两种培养液，DMEM-F12 10%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu（10 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F12 15%FBS中每20mL加67μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。
小鼠心肌切片描述
小鼠心肌切片描述小鼠心肌切片描述引言：小鼠心肌切片是一种常用的实验方法，用于研究心脏疾病、药物筛选和心肌细胞功能等方面。
本文将详细描述小鼠心肌切片的制备过程和切片的形态学特征。
一、材料与方法1. 实验动物：使用12-16周龄的雄性C57BL/6小鼠。
2. 心脏采集：通过颈部剪开皮肤和颈动脉，注射适量的异氟醚进行全身麻醉，然后迅速取出心脏。
3. 心脏固定：将心脏迅速置于冰冷的PBS缓冲液中，并用注射器注入PBS缓冲液进行灌洗，以去除血液。
4. 心脏包埋：将固定好的心脏放入OCT复合剂中，并迅速冷冻至-80°C保存。
二、切片制备1. 切片设备准备：将冷藏好的OCT包埋组织块取出，放在-20°C环境下静置5分钟，使其变硬。
2. 切片装置准备：将冷冻组织块放入切片装置中，调整切片角度和厚度。
3. 切片过程：使用冷冻切片机，将心肌组织块切成30-50μm的薄片，收集在含有PBS缓冲液的离心管中。
4. 心肌切片保存：将收集好的心肌切片置于PBS缓冲液中，并尽快进行下一步处理。
三、形态学特征1. 组织结构：小鼠心肌切片呈现典型的心肌细胞排列方式，具有明显的纤维结构。
心肌细胞之间紧密相连，形成纵横交错的网状结构。
2. 细胞形态：小鼠心肌细胞呈长条状，具有分支和突起。
细胞内可见明显的横纹和线粒体等器官结构。
3. 组织染色：常用荧光染料如荧光素酶或达科西亚染色可以标记特定蛋白质或核酸分子，用于研究不同类型的心肌细胞或标记特定信号通路。
四、应用领域1. 心脏疾病研究：通过小鼠心肌切片可以观察心脏组织的形态和结构变化，研究心脏病理生理过程，如心肌纤维化、心肌细胞凋亡等。
2. 药物筛选：使用小鼠心肌切片可以评估药物对心肌细胞功能的影响，如钙离子调节、离子通道活性等，为新药开发提供参考。
3. 心肌细胞功能研究：通过小鼠心肌切片可以进行电生理实验，如整体细胞膜电位记录和钙离子成像等，研究心肌细胞的电活动和收缩功能。
乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定_辛毅
（ 1 ． Beijing Anzhen Hospital， Capital Medical University， Department of Experimental Center， Beijing Institute of Heart， Lung and Blood Vessel Diseases， Beijing 100029 ， China； 2 ． Beijing Anzhen Hospital， Capital Medical University， Department of Molecular Beijing Institute of Heart， Lung and Blood Vessel Diseases， Beijing 100029 ， China； 3 ． Department of Cardiac Surgery， Biology， Beijing Anzhen Hospital， Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100029 ， China） Abstract： Objective To build the isolation， culture and identification techniques of cardiac fibroblasts and cardiac The heart of neonate mouse was cut into pieces， then type Ⅱ collagenase plus trypsimyocytes of neonate mouse． Methods
［23 ］
泡 10 s， 转移至超净台。将乳鼠固定于左手掌中， 右 手用无菌棉签蘸体积分数 75% 酒精消毒胸、 腹部皮 肤 3 次。用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上 开胸后， 用剪子压住胸骨右缘， 使心脏自然跳出， 用 取 出 心 脏， 置于装有预冷 弯镊 子 勾 住 心 尖 根 部， 0. 01 mol · L － 1 磷酸盐缓冲溶液 （ phosphate buffered PBS） 的培养皿中。 将鼠心脏全部取出后， solution， 剪去心房、 剔除心脏上结缔组织、 脂肪及血管， 于预
［23 ］
泡 10 s， 转移至超净台。将乳鼠固定于左手掌中， 右 手用无菌棉签蘸体积分数 75% 酒精消毒胸、 腹部皮 肤 3 次。用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上 开胸后， 用剪子压住胸骨右缘， 使心脏自然跳出， 用 取 出 心 脏， 置于装有预冷 弯镊 子 勾 住 心 尖 根 部， 0. 01 mol · L － 1 磷酸盐缓冲溶液 （ phosphate buffered PBS） 的培养皿中。 将鼠心脏全部取出后， solution， 剪去心房、 剔除心脏上结缔组织、 脂肪及血管， 于预
心肌细胞的电生理特性
膜 电 位
当膜电位从－90 mV去极化达阈电位(－70 mV)时， Na+通道几乎全部被激活
膜 电 位
去极化后Na+通道很快（数ms内）全部失活，处于 失活状态的Na+通道不能再次被激活
膜 电 位
随着时间的推移，一直要等到膜电位复极重新达到 -90 mV时，Na+通道才全部恢复至备用状态。
膜 电 位
长(约200～300ms)
，相当于心肌收缩活
动的整个收缩期及舒
张期早期。此期间，
任何刺激均不发生兴
奋和收缩。
意义：心肌不发生完全强直收缩，保持心脏收 缩与舒张交替的节律活动，使心脏泵血功能得 以完成。
心肌动作电位与张力 骨骼肌动作电位与张力
（二）心肌细胞的自律性
自律性的定义：在没有外来刺激的
条件下，心肌能自动地、按一定节律 发生兴奋的能力，称为自动节律性 (auto-rhythmicity，简称自律性)。 心肌的自律性起源于心肌细胞本身。
从0相→－60 mV刺激不产生AP — 有效不应期
（2）相对不应期
当膜电位复极到 －60→－80 mV， 用阈上强刺激才 能产生动作电位 此期产生的AP复 极时程短，不应 期亦短，易导致 心律失常
（3）超常期
mV
-
超 常 期
RRP
• 复极至膜电位－80→－90mV
略低于正常阈值的刺激即可
产生动作电位，兴奋性高于
2. 心脏的起搏点
正常情况下:
①正常起搏点：
窦房结的自律性最高，心脏按 窦房结的节律活动，。
②潜在起搏点：
窦房结以外的其他自律组织并 不表现出其自身的自律性，只 起兴奋传导作用，故称之为潜 在起搏点。
心脏整体只能由一个起搏点主宰Leabharlann 窦房结（正常起搏点）控制心律的机制
当膜电位从－90 mV去极化达阈电位(－70 mV)时， Na+通道几乎全部被激活
膜 电 位
去极化后Na+通道很快（数ms内）全部失活，处于 失活状态的Na+通道不能再次被激活
膜 电 位
随着时间的推移，一直要等到膜电位复极重新达到 -90 mV时，Na+通道才全部恢复至备用状态。
膜 电 位
长(约200～300ms)
，相当于心肌收缩活
动的整个收缩期及舒
张期早期。此期间，
任何刺激均不发生兴
奋和收缩。
意义：心肌不发生完全强直收缩，保持心脏收 缩与舒张交替的节律活动，使心脏泵血功能得 以完成。
心肌动作电位与张力 骨骼肌动作电位与张力
（二）心肌细胞的自律性
自律性的定义：在没有外来刺激的
条件下，心肌能自动地、按一定节律 发生兴奋的能力，称为自动节律性 (auto-rhythmicity，简称自律性)。 心肌的自律性起源于心肌细胞本身。
从0相→－60 mV刺激不产生AP — 有效不应期
（2）相对不应期
当膜电位复极到 －60→－80 mV， 用阈上强刺激才 能产生动作电位 此期产生的AP复 极时程短，不应 期亦短，易导致 心律失常
（3）超常期
mV
-
超 常 期
RRP
• 复极至膜电位－80→－90mV
略低于正常阈值的刺激即可
产生动作电位，兴奋性高于
2. 心脏的起搏点
正常情况下:
①正常起搏点：
窦房结的自律性最高，心脏按 窦房结的节律活动，。
②潜在起搏点：
窦房结以外的其他自律组织并 不表现出其自身的自律性，只 起兴奋传导作用，故称之为潜 在起搏点。
心脏整体只能由一个起搏点主宰Leabharlann 窦房结（正常起搏点）控制心律的机制
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1.2 胚胎心肌细胞的分离及培养(无菌条件下操 作) 将所需胎龄的孕鼠取出, 以颈椎脱臼法处死后, 剪开腹腔, 取出胚胎, 置于冰 PBS (mmol/L)溶液(NaCl
120, KCl 5.4, MgSO4 5, Na-Pyruvat 5, taurine 20, HEPES 10, glucose 20)中。去掉胎膜及胎盘, 用尖镊子将心 脏取出放入另一盛有冷 PBS培养皿中, 置于体视显微 镜下, 分离出心房和心室(在 10.5 d 之前, 心房尚未发 育) 。把心房和心室剪碎分别置于酶解液中
自对鸡胚和新生大鼠心室肌细胞的研究报告[3,4]。心 肌肥大会使胚胎时期出现过的基因重新表达[5], 所以 在胚胎心脏上曾经存在的电流可能会在病理情况下重 新表现, 从而导致某些心脏病的发生, 事实上, 在自发 性高血压大鼠和人体衰竭心脏的心室肌细胞上都记录
Received 2003-11-25 Accepted 2004-02-18 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30070279). *Corresponding author. Tel: +86-27-83692622; Fax: +86-27-83692608; E-mail: tangming49@
择跳动的细胞做膜片钳实验。图 1 为 16.5 d 的单个 胚胎心肌细胞。
2.2 胚胎心肌细胞的 If 电生理特性 图 2A 中，左图是 If 通道稳态激活曲线的原始
(Collagenase B: 1 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals, Mannheimm, Germany; CaCl2 10 mmol/L, 3 µl/ml)酶解, 温度 37℃, 时间 35~37 min。用 KB (mmol/L)液 (KCl 85、K2HPO4 30、MgSO4 5、EGTA 1、Na2ATP 2、 pyruvate 5、kreati 5、taurine 20、glucose 20)终止消 化并震荡 30 min 后, 将分离下来的单个心肌细胞(5 × 105~1 × 106 个 /ml) 2~3 滴滴入预先放有盖玻片(预铺 明胶)的培养皿中, 加含有 20% 胎牛血清的 DMEM 培 养基(Gibco 公司), 置于 37℃, 5% CO2 培养箱中培养。 18~24 h 后, 选用跳动的心肌细胞进行膜片钳实验。
Department of Physiology, Tongji Medical College of Huazhong Universityhan 430030, China
Abstract: To explore the electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes, single embryonic cardiomyocytes were obtained from mice at different periods by a collegenase B digestion approach, whole cell patch clamp recording technique was used to record If and ICa-L, and spontaneous action potential was also recorded. The morphological and spontaneous contractile properties of the isolated cells appeared to be typical embryonic cardiomyocytes when the cells were assessed by phase-contrast microscope. Whole cell recording of isolated cells is easily performed by the whole cell patch clamp technique. Elelctrophysiolgical properties of If and Ica-L from embryonic cardiomyocytes have been proved to be similar to those from adult pacemaker cells or cardiomyocytes. The established method of isolation is simple, stable, effective and reliable. It allows to obtain as early as 8.5-day embryonic myocytes. The electrophysiological recording of embryonic cardiomyocytes will provide a useful model for exploring the electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes and the possible mechanism underlying some heart diseases.
关键词: 胚胎; 心肌细胞; 小鼠; 分离 中图分类号: Q463; R329
Isolation and electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes in mice
LUO Hong-Yan, TANG Ming*, HU Xin-Wu, SONG Ming-Ke, LIANG Hua-Min, DU Yi-Mei, ZHANG Yi
1.4 数据分析 电流强度的测定: 在激活过程中电流刚 出现时与电流最大激活时之间的差值。电流密度的 测定: 电流强度与膜电容的比值(pA/pF)。数据以mean ± SE 的形式表示。
2 结果
2.1 细胞的形状和状态 采用上述方法分离获得的单个胚胎心肌细胞的形
态, 早期胚胎心肌细胞多呈圆形, 细胞显得较厚实; 晚 期胚胎心肌细胞多类似卵圆形, 细胞核清晰, 细胞膜 边界清楚, 细胞有节律性的自发跳动, 记录电流时,选
1.3 电生理研究 细胞置于倒置显微镜(Zeiss,Germany) 上的恒温灌流槽中, 温度控制在37℃, 先用标准台氏 液灌流(mmol/L): NaCl 140、NaOH 2.3、KCl 5.4、CaCl2 1.8、MgCl21、HEPES 10、glucose 10, pH 7.4 (adjusted with NaOH)。记录 If 电流时台氏液中加入以下物质
华中科技大学同济医学院生理系, 武汉 430030
摘 要: 本文旨在探索小鼠胚胎心肌细胞的分离方法并观察其电生理特性。应用胶原酶 B 消化法获得不同时期单个小鼠胚胎 心肌细胞; 利用全细胞膜片钳技术, 记录胚胎心肌细胞的超极化激活的非选择性内向阳离子电流(If)和 L- 钙电流( ICa-L ), 并用电流 钳记录其自发性动作电位。胚胎心肌细胞通过相差显微镜依据其形态和自发性收缩进行鉴定。本法分离所获得的胚胎心肌 细胞容易进行全细胞膜片钳记录, 可用于记录 If、ICa-L 电流和自发性动作电位, 已证实胚胎心肌细胞 If 和 ICa-L 的电生理特性与 成年起搏细胞或心肌细胞相似。本实验建立的分离方法简单、稳定、有效、可靠, 最早可获得 8.5 d 的胚胎心肌细胞。胚 胎心肌细胞的电生理记录为探索胚胎心肌细胞的电生理特性提供了一个可用的模型, 并可能为某些心脏疾病产生的机制提供实 验依据。
玻璃毛细管(南京六合县泉水教学实验仪器厂)经 两步法拉制, 冲灌电极内液后阻抗为 2~5 MΩ。记 录 If 电极内液成分(mmol/L): NaCl 10、potassium aspartate 130、Na2ATP 2、EGTA 1、MgCl2 2、Na2GTP 0.1、HEPES 10, pH 7.2 (adjusted with KOH)。记录 ICa-L 电极内液成分(mmol/L): CsCl 115、HEPES 10、 EGTA 10、Tea-Cl 20、MgATP 5、Tris-GTP 0.1、 phosphocreatine 10、CaCl2 1, pH 7.2 (adjusted with CsOH)。膜电容(Cm)由 ISO2 程序自动测出, 数据存 盘, 实验后用 ISO2 和 Sigma Plot 6.0 软件分析。
652
生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2004, 56(5): 651-655
到了 If [1, 2]。肥大和衰竭心脏的心室肌细胞重新表达 If, 可能与心律失常的发生有关。故研究胚胎心肌细 胞有利于研究心脏的病理生理学现象, 阐明某些心脏 病的病理生理机制, 对于临床心脏病的防治有重要的 参考价值。过去研究胚胎心肌细胞的离子通道特性 多应用鸡胚胎心肌细胞[3], 而分离最早期的小鼠胚胎 心肌细胞一般为 10.5 d[6], 11.5 d[7], 原因主要是早期胚 胎心脏细小, 我室对其分离方法进行了改良, 采用胶 原酶B消化的方法可获得8.5 d的胚胎心肌细胞, 对研 究极早期的胚胎心肌细胞的电生理特点有重要意义。
Key words: embryo; cardiomyocyte; mice; isolation
近年来的研究发现, 肥大及衰竭心脏的基因表达 和信号转导模式与胚胎心脏的情形极为相似[1, 2], 或者 说是其幼稚状态的反演。If 主要分布在自律性心肌细 胞上, 但是已有研究发现, 幼稚心脏(处于胚胎期和新 生期)的心室肌细胞上也有If通道的表达, 这些结论来
(mmol/L): CdCl2 0.5、BaCl2 1、4-aminopyridine 2, 以 排除 ICa、IK1 和 Ito 的干扰。记录 ICa-L 电流时台氏液 中加入 50 µmol/L 的 TTX 阻断 INa 电流。
120, KCl 5.4, MgSO4 5, Na-Pyruvat 5, taurine 20, HEPES 10, glucose 20)中。去掉胎膜及胎盘, 用尖镊子将心 脏取出放入另一盛有冷 PBS培养皿中, 置于体视显微 镜下, 分离出心房和心室(在 10.5 d 之前, 心房尚未发 育) 。把心房和心室剪碎分别置于酶解液中
自对鸡胚和新生大鼠心室肌细胞的研究报告[3,4]。心 肌肥大会使胚胎时期出现过的基因重新表达[5], 所以 在胚胎心脏上曾经存在的电流可能会在病理情况下重 新表现, 从而导致某些心脏病的发生, 事实上, 在自发 性高血压大鼠和人体衰竭心脏的心室肌细胞上都记录
Received 2003-11-25 Accepted 2004-02-18 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30070279). *Corresponding author. Tel: +86-27-83692622; Fax: +86-27-83692608; E-mail: tangming49@
择跳动的细胞做膜片钳实验。图 1 为 16.5 d 的单个 胚胎心肌细胞。
2.2 胚胎心肌细胞的 If 电生理特性 图 2A 中，左图是 If 通道稳态激活曲线的原始
(Collagenase B: 1 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals, Mannheimm, Germany; CaCl2 10 mmol/L, 3 µl/ml)酶解, 温度 37℃, 时间 35~37 min。用 KB (mmol/L)液 (KCl 85、K2HPO4 30、MgSO4 5、EGTA 1、Na2ATP 2、 pyruvate 5、kreati 5、taurine 20、glucose 20)终止消 化并震荡 30 min 后, 将分离下来的单个心肌细胞(5 × 105~1 × 106 个 /ml) 2~3 滴滴入预先放有盖玻片(预铺 明胶)的培养皿中, 加含有 20% 胎牛血清的 DMEM 培 养基(Gibco 公司), 置于 37℃, 5% CO2 培养箱中培养。 18~24 h 后, 选用跳动的心肌细胞进行膜片钳实验。
Department of Physiology, Tongji Medical College of Huazhong Universityhan 430030, China
Abstract: To explore the electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes, single embryonic cardiomyocytes were obtained from mice at different periods by a collegenase B digestion approach, whole cell patch clamp recording technique was used to record If and ICa-L, and spontaneous action potential was also recorded. The morphological and spontaneous contractile properties of the isolated cells appeared to be typical embryonic cardiomyocytes when the cells were assessed by phase-contrast microscope. Whole cell recording of isolated cells is easily performed by the whole cell patch clamp technique. Elelctrophysiolgical properties of If and Ica-L from embryonic cardiomyocytes have been proved to be similar to those from adult pacemaker cells or cardiomyocytes. The established method of isolation is simple, stable, effective and reliable. It allows to obtain as early as 8.5-day embryonic myocytes. The electrophysiological recording of embryonic cardiomyocytes will provide a useful model for exploring the electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes and the possible mechanism underlying some heart diseases.
关键词: 胚胎; 心肌细胞; 小鼠; 分离 中图分类号: Q463; R329
Isolation and electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes in mice
LUO Hong-Yan, TANG Ming*, HU Xin-Wu, SONG Ming-Ke, LIANG Hua-Min, DU Yi-Mei, ZHANG Yi
1.4 数据分析 电流强度的测定: 在激活过程中电流刚 出现时与电流最大激活时之间的差值。电流密度的 测定: 电流强度与膜电容的比值(pA/pF)。数据以mean ± SE 的形式表示。
2 结果
2.1 细胞的形状和状态 采用上述方法分离获得的单个胚胎心肌细胞的形
态, 早期胚胎心肌细胞多呈圆形, 细胞显得较厚实; 晚 期胚胎心肌细胞多类似卵圆形, 细胞核清晰, 细胞膜 边界清楚, 细胞有节律性的自发跳动, 记录电流时,选
1.3 电生理研究 细胞置于倒置显微镜(Zeiss,Germany) 上的恒温灌流槽中, 温度控制在37℃, 先用标准台氏 液灌流(mmol/L): NaCl 140、NaOH 2.3、KCl 5.4、CaCl2 1.8、MgCl21、HEPES 10、glucose 10, pH 7.4 (adjusted with NaOH)。记录 If 电流时台氏液中加入以下物质
华中科技大学同济医学院生理系, 武汉 430030
摘 要: 本文旨在探索小鼠胚胎心肌细胞的分离方法并观察其电生理特性。应用胶原酶 B 消化法获得不同时期单个小鼠胚胎 心肌细胞; 利用全细胞膜片钳技术, 记录胚胎心肌细胞的超极化激活的非选择性内向阳离子电流(If)和 L- 钙电流( ICa-L ), 并用电流 钳记录其自发性动作电位。胚胎心肌细胞通过相差显微镜依据其形态和自发性收缩进行鉴定。本法分离所获得的胚胎心肌 细胞容易进行全细胞膜片钳记录, 可用于记录 If、ICa-L 电流和自发性动作电位, 已证实胚胎心肌细胞 If 和 ICa-L 的电生理特性与 成年起搏细胞或心肌细胞相似。本实验建立的分离方法简单、稳定、有效、可靠, 最早可获得 8.5 d 的胚胎心肌细胞。胚 胎心肌细胞的电生理记录为探索胚胎心肌细胞的电生理特性提供了一个可用的模型, 并可能为某些心脏疾病产生的机制提供实 验依据。
玻璃毛细管(南京六合县泉水教学实验仪器厂)经 两步法拉制, 冲灌电极内液后阻抗为 2~5 MΩ。记 录 If 电极内液成分(mmol/L): NaCl 10、potassium aspartate 130、Na2ATP 2、EGTA 1、MgCl2 2、Na2GTP 0.1、HEPES 10, pH 7.2 (adjusted with KOH)。记录 ICa-L 电极内液成分(mmol/L): CsCl 115、HEPES 10、 EGTA 10、Tea-Cl 20、MgATP 5、Tris-GTP 0.1、 phosphocreatine 10、CaCl2 1, pH 7.2 (adjusted with CsOH)。膜电容(Cm)由 ISO2 程序自动测出, 数据存 盘, 实验后用 ISO2 和 Sigma Plot 6.0 软件分析。
652
生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2004, 56(5): 651-655
到了 If [1, 2]。肥大和衰竭心脏的心室肌细胞重新表达 If, 可能与心律失常的发生有关。故研究胚胎心肌细 胞有利于研究心脏的病理生理学现象, 阐明某些心脏 病的病理生理机制, 对于临床心脏病的防治有重要的 参考价值。过去研究胚胎心肌细胞的离子通道特性 多应用鸡胚胎心肌细胞[3], 而分离最早期的小鼠胚胎 心肌细胞一般为 10.5 d[6], 11.5 d[7], 原因主要是早期胚 胎心脏细小, 我室对其分离方法进行了改良, 采用胶 原酶B消化的方法可获得8.5 d的胚胎心肌细胞, 对研 究极早期的胚胎心肌细胞的电生理特点有重要意义。
Key words: embryo; cardiomyocyte; mice; isolation
近年来的研究发现, 肥大及衰竭心脏的基因表达 和信号转导模式与胚胎心脏的情形极为相似[1, 2], 或者 说是其幼稚状态的反演。If 主要分布在自律性心肌细 胞上, 但是已有研究发现, 幼稚心脏(处于胚胎期和新 生期)的心室肌细胞上也有If通道的表达, 这些结论来
(mmol/L): CdCl2 0.5、BaCl2 1、4-aminopyridine 2, 以 排除 ICa、IK1 和 Ito 的干扰。记录 ICa-L 电流时台氏液 中加入 50 µmol/L 的 TTX 阻断 INa 电流。