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《大豆食品中异黄酮含量的测定》行业标准编制说明（征求意见稿）一、任务来源年月日，由中国食品工业协会豆制品专业委员会申请行业标准的立项，根据工业和信息化部下达的年第一季度行业标准制修订计划，批准《大豆食品中异黄酮含量的测定》推荐性行业标准的制定本标准由中国食品工业协会豆制品专业委员会组织制定工作。
二、标准的属性本标准是推荐性行业标准。
三、标准的修订原则（一）按照《食品安全法》的相关规定，对现行有关大豆异黄酮含量的测定相关标准进行梳理；（二）结合国内豆制品企业生产实际情况，参考国际相关标准；（三）统筹考虑与《食品安全国家标准豆制品》有效衔接，确保标准的适用性、广泛性、可操作性。
本标准的编写符合《标准化工作导则第部分：标准的结构和编写》。
四、标准主要内容制定情况、大豆异黄酮是一类从大豆中分离出来的具有生理活性的物质，近年来被确定为抗肿瘤作用的功能因子，能够预防和治疗乳腺癌、结肠癌和皮肤癌，改善骨质疏松，能够缓解和减轻女性更年期不适症状，同时可提高机体免疫功能，抗氧化、抗溶血、降低心血管疾病和冠心病的发生。
因此制定科学有效的大豆制品中异黄酮含量的测定方法非常重要。
目前，大豆异黄酮的检测主要有高效液相色谱法（）和高效液相色谱质谱联用法（），液质联用法具有高分辨、高分离能力且灵敏度高等优点，但仪器设备昂贵，难以普及。
法具有分离效果好、准确度高、重现性好、分析速度快和自动化程度高等优点，被广泛采用。
结合我国豆制品行业生产企业现状，采用法实验的可操作性、检测成本费用、应用的广泛性等几方面的问题综合考虑较为实际，且本标准中测定方法与其他分析方法比较具有同时测定种大豆异黄酮单体的含量的优点。
、本标准（国家大豆产业技术研发中心加工研究室）方法：标准品制备：准确称取标准品置于储液瓶中，以的比例（体积比）向其中加入二甲基亚砜()，乙腈，的甲醇溶液，充分溶液标准品，配制成的原始溶液。
单一标准品标准溶液的配制：使用的甲醇溶液将原始溶液稀释成μ的单标标准溶液。
食品中大豆异黄酮的HPLC法测定
刘涛;刘宁
【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2006(22)2
【摘要】为保证保健食品的质量,在比较了现有大豆异黄酮的检测方法的基础上,建立了一套简便、快捷、高准确度、高灵敏度并能长期用于日常大豆异黄酮测定的方法.采用Waters Spherisorb(r)ODS2色谱柱,柱温50 ℃,以甲醇-冰醋酸水溶液体积比(40:60)为流动相,1.2 mL/min的流速,在254 nm用紫外检测器进行检测,其重复测定结果的相对偏差在2.25%,回收率在85%～110%范围内,适用于保健食品中大豆异黄酮的测定.
【总页数】4页(P47-49,54)
【作者】刘涛;刘宁
【作者单位】哈尔滨商业大学,黑龙江,哈尔滨,150076;哈尔滨商业大学,黑龙江,哈尔滨,150076
【正文语种】中文
【中图分类】TS201
【相关文献】
1.HPLC法测定绿豆芽中四种大豆异黄酮的含量 [J], 周光明;李艳艳;辛丹敏
2.大豆异黄酮保健食品中苷及苷元的等度HPLC法测定 [J], 姜丽霞;徐世芳;陈爱瑛;王晗
3.大豆异黄酮保健食品中苷及苷元的等度HPLC法测定 [J], 姜丽霞;徐世芳;陈爱瑛;王晗
4.HPLC法测定保健食品中四种大豆异黄酮的含量 [J], 杨子秋;苏小军
5.大豆及其制品中12种大豆异黄酮的HPLC及HPLC-MS法测定研究 [J], 金米聪;龚文杰;马建明
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高效液相色谱法测定大豆提取物中大豆异黄酮的含量【摘要】奉文建立了大豆提取物中大豆异黄酮酌高效液相色谱测定方法．通过正变试验确定了样品水解。
最佳条件为：1．0t ool／1 H C1一M eO H 溶解、80 ~C 下、回流水解0．5h ．采用 N ova —Pak ClB 3 ．9 ×150m m 4ktm 色谱枉，M eOH —O ．4 ％ PO4(47：53V／V )为流动相，流速 0 ．7ml／min，检测波长 260n111等色谱条件下洲定甙元含量。
通过换算因子计算大豆异黄酮的含量。
该方法快速、灵敏、重现性好，回收率达 99％，变异系数小于 3 ％。
为产品的进一步开发研究打下了盘好基础。
【关键词】大豆提取物；大豆异黄酮；墨兰丝；正变设计法；方差分析；高效液相色谱法0.前言大豆由于富含多种生物活性物质，一直是人们关注的热点。
随着现代研究的不断深入，大豆异黄酮防治心脑血管疾病，预防乳腺癌和骨质疏松症，改善更年期症状等作用逐步被人们所认知。
目前，国内已有十多家企业对其进行研究、生产，但检测方法各异。
采用测定黄酮化合物的比色分析法，样品中有其他色素的干扰；紫外分光光度法虽然方便、快速，但不能测定单一成分，且样品处理不当会有杂质干扰。
鉴于此，有必要研究一种可靠的大豆异黄酮的含量检测分析方法。
大豆异黄酮是多酚类混合物，大豆异黄酮的组成、存在形式主要包括染料术素(gnistein)、大豆黄素(daidzeln)和黄豆黄素 (glyeitein)，天然情况下它们主要以 7 —0 一葡萄糖甙形式存在。
本文对大豆提取物中异黄酮含量的高效液相色谱测定方法进行了系统的研究，并对样品的前处理条件进行探讨。
为产品的进一步开展研究打下了良好的基础。
l .试验材料与方法1．1 仪器高效液相色谱仪,25µL微量注射器,M-50型微孔滤膜，超声波清洗器1．2 试剂与材料对照品大豆黄素、染料木素、黄豆黄素由本实验室分离制备。
NANCHANG UNIVERSITY功能食品学综述论文学院:生命科学与食品工程学院专业:食品科学与工程班级:学号:学生姓名:廖杰指导教师:王远兴起讫日期:2014年 3月至 2014年 4月大豆异黄酮的测定方法摘要本文在参考国内外大量文献的基础上,对大豆异黄酮的测定方法进行了系统的总结和介绍关键词:大豆异黄酮;测定方法Abstract:In reference on the basis of a large number of literature at home and abroad, this paper method of the determination of soybean isoflavones were summarized and introducedKeywords:soy isoflavones method目录摘要 ........................................................................................................................................... .. (I)Abstract:................................................................................................................................. .............. I 目录 ........................................................................................................................................... .......... II 1根据紫外吸收特性检测方法 ......................................................................................................... 1 1.1紫外分光光度法(UV .. (1)1.2三波长法(three–wave length UVspectrophotometry (1)2根据色谱原理检测方法 ................................................................................................................. 2 2.1高效液相色谱法(HPLC ................................................................................................. 2 2.2高效液相色谱―质谱法(HPLC–MS .............................................................................. 2 2.3气相色谱法(GC ............................................................................................................. 2 2.4气相色谱―质谱法(GC–MS .. (3)2.5毛细管电泳法(CE .........................................................................................................3 2.6薄层扫描色谱法(TLCS .................................................................................................. 3 2.7四标样快速测定法 . (3)2.8双向纸层析色谱法(Two–dimensional paperchromatography (4)3根据医学免疫检测方法 ................................................................................................................. 4 3.1时间分辨荧光免疫分析法(TR–FIA .............................................................................. 4 3.2酶联免疫吸附法(ELISA . (4)3.3放射免疫测定法 (5)4各检测方法系统归纳和分析 ......................................................................................................... 5附:各国际组织采用的检测方法及标准 ........................................................................................ 6参考文献 ........................................................................................................................................... .. 7大豆异黄酮 (Soybean isoflavones , ISO 是一种从大豆中分离提取活性成分, 具有异黄酮类化合物典型结构, 包括三种游离型异黄酮苷元和九种结合型大豆异黄酮。
大豆异黄酮的测定方法本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定。
本方法大豆异黄酮染料木素的最低检出限为10ng；大豆苷元的最低检出限为30ng。
1、方法提要大豆异黄酮（soybean isoflavones，简称ISO）是一类以大豆中分离提取的具有抗氧化、抗肿瘤、改善心血管功能的主要活性成分。
目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种，染料木素（Genistein，G）和大豆苷元（Daidzeiu，D）是其中两种重要化合物。
本法用80%乙醇作为溶剂，提取样品中的染料木素、大豆苷元，以反相高效液相色谱分离，在紫外检测器260nm条件下检测其峰面积，以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量。
2、仪器（1）LC高效液相色谱仪，C—RIB色谱处理机。
（2）检测器：SPD—2AS紫外检测器。
（3）离心机。
（4）超声波振荡器。
3、试剂（1）甲醇（色谱纯）。
（2）乙醇（优级纯）。
（3）双重蒸馏水。
（4）大豆异黄酮标准品：染料木素与大豆苷元标准品（美国Sigma公司产品），以染料木素和大豆苷元两项之和作为大豆异黄酮含量计算。
（5）大豆异黄酮标准溶液：准确称取染料木素标准品 5.0mg，大豆苷元标准品3.2mg，各自用流动相“甲醇＋水（60＋40）”定容至100mL，配制成50μg/mL的染料木素和32μg/mL的大豆苷元标准溶液。
4、测定步骤（1）样品处理：a、固体样品：准确称取一定量固体粉末样品于100mL容量瓶中，定量加入80%乙醇，经超声振荡5min，加水补足至刻度，待提取液略澄清后经离心分离（3000r/min，5min），取上清液经0.45μm滤膜过滤后待进样。
b、液体样品：准确吸取2.0mL液体样品，加入80%乙醇摇匀并定容100mL，澄清后同上述步骤。
（2）色谱分离条件：色谱柱：Shim—Pack CLC—ODS，6mm×150mm，5μm。
流动相：甲醇＋水（60＋40），临用前用超声波除气。
豆制品中异黄酮成分的提取与含量测定在全球范围内，豆制品是一种非常重要的食品之一。
不仅因为它们是一种丰富的蛋白质来源，还因为它们富含一种被称为异黄酮的天然化合物。
异黄酮是一类具有植物雌激素活性的化合物，许多研究表明它们具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等生理活性。
提取和测定豆制品中的异黄酮成分对于研究其健康功效以及产品质量控制具有重要意义。
提取豆制品中的异黄酮成分是一个关键步骤。
首先，我们需要选择一种合适的溶剂来提取。
乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂都适用于异黄酮的提取。
在选择溶剂的同时，还需要考虑提取时间和温度等因素。
一般来说，较长的提取时间和较高的提取温度可以增加异黄酮的提取率，但也可能会导致一些热敏感的化合物的降解。
因此，需要在选择提取条件时进行优化。
提取后，我们需要对提取液进行浓缩和净化。
常见的浓缩方法包括旋转蒸发和真空浓缩等。
净化的方法主要包括液液萃取、固相萃取和高效液相色谱等。
液液萃取是一种简单有效的方法，它基于不同化合物在不同相中的分配差异。
固相萃取则利用固相萃取柱具有特异性吸附特性的原理，可以方便地分离目标化合物。
高效液相色谱是一种非常常用的分析方法，可以将样品中的异黄酮分离并测定其含量。
在测定豆制品中的异黄酮含量时，可以使用不同的分析技术。
常用的分析方法包括紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和质谱等。
紫外-可见吸收光谱是一种简单方便的分析方法，适用于异黄酮的定性和定量分析。
荧光光谱则具有更高的灵敏度和选择性，可以用于低浓度异黄酮的检测。
质谱是一种非常灵敏和准确的分析方法，可以通过测定分子的质量和碎片的质量谱图来确定异黄酮的结构和含量。
除了选择合适的分析方法，还需要建立准确可靠的分析方法。
分析方法的准确性和可靠性依赖于样品的预处理、标准曲线的建立和质控样品的应用等。
因此，在进行异黄酮含量测定前，需要对分析流程进行验证，并建立相应的质量控制措施。
总之，提取和测定豆制品中的异黄酮成分是一项重要的研究工作。
通过选择合适的提取方法和分析技术，可以准确地测定豆制品中异黄酮的含量，并深入研究其健康功效。
大豆食品中异黄酮含量1 范围本标准规定了大豆食品中异黄酮（大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄苷）含量测定的高效液相色谱法。
本标准适用于原料大豆及豆浆、豆腐、腐乳等大豆食品中异黄酮含量的测定。
本标准测试方法的线性范围：0.5μg/mL～100μg/mL。
本标准测试方法的检出限：2.5μg/kg。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义3.1 大豆异黄酮（soybean isoflavones）大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，属于天然黄酮类物质，具有异黄酮类化合物的典型结构。
大豆中以异黄酮葡萄糖苷和相应苷元形式存在的物质，包括大豆苷（Daidzin）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木素（Genistein）、黄豆黄素（Glycitein）、黄豆黄苷（Glycitin）。
其分子式如下：大豆苷（C21H20O9）、染料木苷（C21H20O10）、大豆苷元（C15H10O4）、染料木素（C15H10O5）、黄豆黄素（C16H12O5）、黄豆黄苷（C22H22O10）。
4 原理样品经过乙腈-水溶液震荡提取，提取液经离心、浓缩后用80％甲醇定容、过滤，经高效液相色谱分析（C18柱分离），在260nm条件下测定，依据保留时间定性，用外标法定量。
5 试剂和材料本标准使用符合 GB/T 6682-2008 规定的一级水。
除另有规定仅使用分析纯试剂。
5.1 试剂5.1.1 甲醇（Methanol，CH3OH）：色谱纯。
5.1.2 乙腈（Acetonitrile，C2H3N）：色谱纯。
5.1.3 二甲基亚砜（DMSO，C2H6OS）。
5.1.4 冰醋酸（AceticAcid，CH3COOH）。
保健食品中大豆异黄酮的检验方法--------------高效液相色谱（HPLC）法中华人民共和国食品工业标准编制说明1．任务来源国家标准《保健食品中大豆异黄酮的检验方法》制修订是根据全国食品工业标准化委员会的要求，由朝阳区产品质量监督检验所负责，与红牛维他命饮料有限公司协作，进行制订工作（项目编号：20079432-T-469），根据项目内容确定了该项工作的具体方案和工作计划，按照项目要求开展工作。
2．意义大豆异黄酮是一类具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质，也是目前国际上公认的安全有效的天然植物雌激素。
目前发现的大豆中天然存在的大豆异黄酮共有12种,分为游离型的甙元和结合型的糖甙两类，游离型的甙元约占总量的2%－3%，包括染料木素(Genistein),大豆黄素(Daizein)和黄豆黄素(Glycitein), 结合型的糖甙约占总量的97%－98%。
已发现大豆异黄酮是一种优良的天然抗氧化剂，具有多种生物活性，如对肿瘤、心血管疾病、骨质疏松症和更年期综合症预防与治疗作用。
因此，当前国际上特别是美国和日本对大豆异黄酮开展了大量的应用研究工作，以大豆异黄酮为主要成分的保健食品已成为一种新型畅销食品。
据统计，国内外市场上含有大豆异黄酮的保健食品达数十种之多。
主要有片剂、胶囊、口服液、饮料等。
例如，威海清华紫光科技生产的金奥力大豆异黄酮胶囊，成都中科生物技术开发有限公司生产的天雌大豆异黄酮营养片( 胶囊)、红牛维他命饮料有限公司开发的大豆异黄酮保健饮料、广东九极日用保健品有限公司生产的九极牌丽延口服液等。
美国C1ifbar公司开发出添加了大豆异黄酮的运动饮料，美国加州Imagine食品公司开发含大豆异黄酮、蛋白质、碳水化合物、23种维生素和矿物质的能量饮料。
不同的产品，大豆异黄酮的含量也不同，目前保健品市场上片剂一般每片（500mg）约含大豆异黄酮几十毫克，胶囊每粒含大豆异黄酮几十毫克，口服液饮料每一百毫升含大豆异黄酮几十到上百毫克，大豆异黄酮粉末含大豆异黄酮为每克一百到几百毫克。
《大豆食品中异黄酮含量的测定》行业标准编制说明
（征求意见稿）
一、任务来源
2016年3月22日，由中国食品工业协会豆制品专业委员会申请行业标准的立项，根据工业和信息化部下达的2016年第一季度行业标准制修订计划，批准《大豆食品中异黄酮含量的测定》推荐性行业标准的制定
本标准由中国食品工业协会豆制品专业委员会组织制定工作。
二、标准的属性
本标准是推荐性行业标准。
三、标准的修订原则
（一）按照《食品安全法》的相关规定，对现行有关大豆异黄酮含量的测定相关标准进行梳理；
（二）结合国内豆制品企业生产实际情况，参考国际相关标准；
（三）统筹考虑与《食品安全国家标准豆制品》有效衔接，确保标准的适用性、广泛性、可操作性。
本标准的编写符合GB1.1《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》。
四、标准主要内容制定情况
1、大豆异黄酮是一类从大豆中分离出来的具有生理活性的物质，近年来被确定为抗肿瘤作用的功能因子，能够预防和治疗乳腺癌、结肠癌和皮肤癌，改善骨质疏松，能够缓解和减轻女性更年期不适症状，同时可提高机体免疫功能，抗氧化、抗溶血、降低心血管疾病和冠心病的发生。
因此制定科学有效的大豆制品中异黄酮含量的测定方法非常重要。
目前，大豆异黄酮的检测主要有高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS），液质联用法具有高分辨、高分离能力且灵敏度高等优点，但仪器设备昂贵，难以普及。
HPLC法具有分离效果好、准确度高、重现性好、分析速度快和自动化程度高等优点，被广泛采用。
结合我国豆制品行业生产企业现状，采用HPLC法实验的可操作性、检测成本费用、应用的广泛性等几方面的问题综合考虑较为实际，且本标准中测定方法与其他HPLC分析方法比较具有同时测定12种大豆异黄酮单体的含量的优点。
2、本标准（国家大豆产业技术研发中心加工研究室）方法：
标准品制备：准确称取1 m g标准品置于储液瓶中，以1:1:2的比例（体积比）向其中加入二甲基亚砜(DMSO)，乙腈，80%的甲醇溶液，充分溶液标准品，配制成1 mg/mL 的原始溶液。
单一标准品标准溶液的配制：使用80%的甲醇溶液将原始溶液稀释成100 μg/mL的单标标准溶液。
混合标准品标准溶液的配制：等量吸取各标准品原液混合，加80%的甲醇溶液配制成100 μg/mL混标标准溶液原液，并逐步稀释配制成1～60μg/mL不同浓度梯度溶液以制作标准曲线.
样品处理方法是将样品冷冻干燥制成粉末，准确称取样品粉末，置于离心管中，按1:10（g：mL）的比例向其中加入等体积的乙腈和超纯水，密封后充分混匀，使用摇床在300 r/min室温下震荡提取2h。
然后使用离心机在6000 r/min 条件下室温下离心20 min，上清液通过慢速定量滤纸进行过滤。
滤液通过旋转蒸发仪在35℃条件下蒸发至干，向其中加入5 ml 80%的甲醇溶液以溶解干物质，通过0.22 μm的有机系过滤器过滤处理过后的样品溶液，除去不容物。
在-20℃条件下冷冻保存备用。
试验数据通过LC-Solution 工作站进行记录，数据分析采用Excel进行统计分析。
3、本标准试验方法中色谱条件：
色谱柱：C18 (5μm、4.6 mm * 250 mm)；
流动相A：含有0.1%乙酸的超纯水溶液；
流动相B：含有0.1%乙酸的乙腈溶液；
柱温：35 ℃；
进样量：20 μL；
检测波长：262 nm；
流速：1.2 mL/min。
4、本标准采用的方法的确定过程：
1）对洗脱梯度的确定：试验中发现，丙二酰基染料木苷和乙酰基黄豆黄苷非常难以分离，通过对流动相比例的细微改变，在保证上述两种物质完全分离的情况下，同时也要保证其他的单体峰很好的分离，在进行了大量实验对比，证明图1所示的洗脱梯度较为有效，对12种异黄酮的标品分离如图2所示。
图1 优化后的流动相洗脱梯度
图2 标准品HPLC色谱图
1——大豆苷； 7——丙二酰基染料木苷；2——黄豆黄苷； 8——乙酰基黄豆黄苷；
3——丙二酰基大豆苷； 9——大豆苷元；
4——丙二酰基黄豆黄苷； 10——黄豆黄素；
5——染料木苷； 11——乙酰基染料木苷；6——乙酰基大豆苷； 12——染料木素
2）对流速的确定：在对12种大豆异黄酮单体进行一次分离的同时，分别对流动相流速1.0和1.2 mL/min进行了试验，结果表明：1.2 mL/min 的流速能够
有效的分开各种大豆异黄酮单体而且能够节约单次试验时间。
3）对进样量的确定：试验通过对10 μL 和20 μL不同进样量的对比得出：进样量对出峰时间以及进样器定量环为20 μL，为使试验结果更为精密可靠，试验采用20 μL 为进样体积。
4）定量分析方法的建立：通过对单一标准品的HPLC测定，得到每一种标准品对应的出峰时间，并在混合标准品的色谱图中找出对应的标准品。
出峰的顺序为大豆苷（D）、黄豆黄苷（GL）、丙二酰基大豆苷（MD）、丙二酰基黄豆黄苷（MGL）、染料木苷（G）、乙酰基大豆苷（AD）、丙二酰基染料木苷（MG）、乙酰基黄豆黄苷（AGL）、大豆苷元（De）、黄豆黄素（Gle）、乙酰基染料木苷（AG）、染料木素（Ge）；出峰时间分别为：18.88、21.49、34.42、37.12、42.13、48.87、51.55、52.39、56.63、58.91、59.90和70.03min。
通过对不同浓度梯度混合标准品标准溶液的HPLC检测，能够得出12种大豆异黄酮单体浓度与峰面积具有良好的线性关系，见表1。
表1 大豆异黄酮各组分回归方程
5）精密度与稳定性试验：对12种异黄酮组分混合标准品进行日内稳定性及
日间稳定性测定，本方法具有良好的精密度与较好的稳定性，测定结果见表2。
由表2可知：本标准方法日内与日间稳定性测定结果具有良好的精密度与较好的稳定性。
表2 精密度与稳定性试验
五、国内外标准情况
《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法》方法：
标准品制备：称取大豆苷、大豆黄苷和染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素（纯度均为98.0%以上）各4 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加入二甲基亚砜至接近刻度，超声处理30 min，再用二甲基亚砜定容。
各标准储备液浓度均为400 mg/L。
混合标准使用溶液配制：8.0 mg/L 混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准储备溶液各0.2 mL 于10 mL 容量瓶中，加入等体积水，用50%二甲基亚砜溶液定容。
依同样方法分别配制16.0 mg/ L、24.0 mg/ L、32.0 mg/L、40.0 mg/L的混合标准使用
溶液。
样品处理：固体样品粉碎、磨细（过80目筛）、混匀，半固体样品混匀，称取样品0.05 g～0.5 g（精确至0.1mg），用80%甲醇溶液溶解并转移至50 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液至接近刻度；液体样品：吸取混匀液体样品0.5 mL～5.0 mL 于50 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液至接近刻度。
将上述样品溶液用超声波振荡器震荡20 min，用80%甲醇定容，摇匀。
取样品溶液置于离心管中，离心机离心15 min（转速大于8000 r/min）。
取上清液用滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，收集滤液备用。
在标准品制备以及试验样品处理方面本标准采用的方法相较于《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法》的优点在于大豆异黄酮单体标准品使用量较少，可以节约试验成本，实验操作相对简便，样品处理方法比较统一，检测结果更具有对比性。
《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法》中色谱条件：
色谱柱：C18,4.6 mm × 250 mm，粒度5 μm不锈钢色谱柱（也可使用分离效果相当的其他不锈钢柱）；
流动相A：乙腈（色谱纯）；
流动相B：磷酸水溶液（PH=3.0）；
柱温：30 ℃；
进样量：10 μL；
检测波长：260 nm；
流速：1.0 mL/min。
目前国内外与之相关的标准有：AOAC Official Method 2001.10 Determination of Isoflavones in Soy and Selected Foods Containing Soy Extraction,Saponification,and Liquid Chromatogrphy First Action 2001；国内的《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法》以及《粮油检验大豆异黄酮含量测定高效液相色谱法》专门针对保健食品和粮油中异黄酮含量的测定。
3中方法均采用测定6种标准异黄酮单体的含量来确定大豆异黄酮的总含量。
本标准的一次测定12种大豆异黄酮单体的HPLC方法可以一次性、准确地检测大豆籽粒及制成品中各的异黄酮组分的含量，且各组分浓度与其对应的峰面积具有良好的线性关系（R2在0.9973～0.9997）。
该方法使用样品量较少，检测异
黄酮含量快速、准确，适合大豆原料样品和大豆制食品的异黄酮含量的分析检测。
中国食品工业协会豆制品专业委员会
二零一七年一月十一日。
