QPCR常见问题及其分析

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。

由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。

当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。

在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。

最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture 里。

如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。

由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。

SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。

而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化PCR虽然为一个简单的实验，但在实际过程中可能会出现各种问题。

产生问题的原因可能来源于以下几个方面：实验操作,试剂质量,PCR反应过程中各种试剂的含量,以及反应条件，温度设置等，本文对各个方面进行了讨论,大家遇到问题后可以对号入座的查一下。

当然，具体问题的解决还依靠实验者就可能的原因逐项排除，并不断的摸索才能彻底解决。

假阴性,不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性,③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究.模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚.⑤模板核酸变性不彻底.在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高,一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

QPCR中常见的问题Q：ROX是什么，有什么作用？A：ROX是一种荧光染料，作为参比信号校正。

试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。

ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。

Q：荧光通道的选择？A：定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光。

TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。

如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。

如果实验要求不高，不做ROX 校正（AB公司不推荐这样做），还可以再多一种荧光用于标记探针。

研究应用本身的要求。

如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。

如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。

Q：内标法和外标法哪种数据更精密？A：是同样可靠的。

内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。

外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。

两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

荧光定量PCR问题疑难解答Q 1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R2=0.998。

但是扩增效率只有80%另外扩增曲线也不光滑。

2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大；或者是扩增产物太少了。

PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。

但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因：1、模板:含有抑制物，含量低2、Buffer对样品不合适3、引物设计不当或者发生降解4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2、更换Buffer或调整浓度3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4、降低退火温度、延长延伸时间问题二：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR2、适当降低模板或引物浓度3、适当减少酶量4、降低镁离子浓度5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法6、减少循环次数问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1、模板不纯2、Buffer不合适3、退火温度偏低4、酶量过多5、dNTP、Mg 2+浓度偏高6、循环次数过多对策：1、纯化模板2、更换Buffer3、适当提高退火温度4、适量用酶5、适当降低dNTP和镁离子的浓度6、减少循环次数问题四：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存[ 来源]：实验室之家，以及相关网络知识、转载仅为分享知识，如有侵权请联系删除。

}热文推荐：1、化学分析方法确认和验证指南PDF版全文（新版2018年4月1日实施）2、最全微生物实验室规划设计方案3、谱知识总结篇4、移液器操作六部曲，这些细节很重要化学先生（号码：chemistrysir），化学检测工作者自己的公众号。

PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化PCR虽然为一个简单的实验,但在实际过程中可能会出现各种问题.产生问题的原因可能来源于以下几个方面：实验操作，试剂质量，PCR反应过程中各种试剂的含量,以及反应条件，温度设置等，本文对各个方面进行了讨论，大家遇到问题后可以对号入座的查一下.当然，具体问题的解决还依靠实验者就可能的原因逐项排除,并不断的摸索才能彻底解决.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改.酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

PCR常见问题分析及计谋(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)2009-03-28 11:38问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品那么无原因:1.模板:含有抑制物，含量低对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与估量的大小不一致或非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯不合适3.退火温度偏低4.酶量过多、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照显现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

v1.0 可编辑可修改QPCR中常见的问题Q：ROX是什么，有什么作用A：ROX是一种荧光染料，作为参比信号校正。

试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。

ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。

Q：荧光通道的选择A：定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光。

TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。

如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan 探针就可以多1种荧光用于标记探针。

如果实验要求不高，不做ROX校正（AB 公司不推荐这样做），还可以再多一种荧光用于标记探针。

研究应用本身的要求。

如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。

如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。

Q：内标法和外标法哪种数据更精密A：是同样可靠的。

内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。

外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。

两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

荧光定量PCR问题疑难解答Q 1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R2=。

但是扩增效率只有80%另外扩增曲线也不光滑。

2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大；或者是扩增产物太少了。

QPCR中常见的问题Q：ROX是什么，有什么作用A：ROX是一种荧光染料，作为参比信号校正。

试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。

ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。

Q：荧光通道的选择A：定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光。

TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。

如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan 探针就可以多1种荧光用于标记探针。

如果实验要求不高，不做ROX校正（AB 公司不推荐这样做），还可以再多一种荧光用于标记探针。

研究应用本身的要求。

如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。

如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。

Q：内标法和外标法哪种数据更精密A：是同样可靠的。

内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。

外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。

两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

荧光定量PCR问题疑难解答Q 1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R2=。

但是扩增效率只有80%另外扩增曲线也不光滑。

2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大；或者是扩增产物太少了。

qPCR实验常见问题及解决方案详解剖析！（建议收藏）在RT-qPCR的实验过程中，大家或多或少都会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常、重复性差等问题。

小翊给大家整理了SYBR Green染料法的常见问题及解决方案，以供大家参考。

Part 1 扩增曲线异常正常的扩增曲线一般呈S型，Ct值最好在20-30之间。

异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。

1.Ct值偏大（如Ct值＞30）1）模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。

2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。

3）扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。

4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

2.扩增曲线无法达到平台期基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。

3. 扩增曲线平台期下降可能是基线范围设置不当，这种一般是由于模板量过高导致的。

建议减小基线的终点值（一般建议设置为Ct值-4），调整后见下图。

4.扩增曲线平台期锯齿状1）RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。

2）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

5.扩增曲线杂乱无规律可能是ROX浓度和机型不匹配，建议调整ROX浓度，调整后见下图。

【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX 导致的。

6.有熔解曲线，无扩增曲线可能是扩增程序设置错误，未进行荧光信号搜集，建议重新实验，增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。

7.扩增曲线有向上或向下的尖峰可能是仪器故障，建议维修仪器。

8. 阴性对照有扩增1）NTC有扩增，可能有以下两种情况：①Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃（一般正常qPCR产物，大小在100-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚体导致，可进一步优化引物。

qPCR常见问题及分析解决办法作者：来源：《食品安全导刊》2017年第04期昆山吉和力仪器有限公司（以下简称“吉和力”）是一家提供专业服务和仪器设备的集成供应商，公司以用户实际需求为导向，提供最合适、性价比最高的仪器，致力于打造一站式服务平台。

为了让业内人士对qPCR进行更加深入的了解，吉和力整理了一些相关常见问题，并对这些问题一一进行了解答。

qPCR的英文全称是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。

简单来说，qPCR就是利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

而常规的PCR无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。

如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性？①确定模板RNA完整性，无DNA污染；②RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂；③为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin；④使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱；⑤若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果；⑥设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

避免RNA降解的方法有哪些？①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；②运用良好无污染技术分离RNA；③将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。

RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA与样品混合，同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂；若对照RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。

荧光定量PCR实验常见问题解答RT-qPCR 常见问题分析Que：荧光定量PCR 失败无特异性产物生成‹ RNA 是否被降解？‹ RNA 中是否包含逆转录反应的抑制剂？‹ 引物和探针序列是否有错误？组合是否正确？‹ Mix 是否所有组分都加入？PCR 条件和荧光检出步骤是否设定正确？Que：产物有非特异性条带‹ 引物和模板非特异性退火，可以使用热启动的Taq DNA 聚合酶进行PCR 反应提高反应特异性‹ 引物设计较差‹ RNA 中有基因组DNA 污染；或者有外源DNA 污染‹ Mg2+浓度过高Que：扩增结果为弥散或者地毯式条带‹ 循环数过多‹ 酶过量‹ 退火温度过低‹ PCR 反应中引物过多Que：无CT 值（信号）出现‹ 反应循环数不够。

一般都要在35 个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45 个循环会增加过多的背景信号。

‹ 检测荧光信号的步骤有误。

一般SYBR Green 法采用延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

‹ 引物或探针降解。

可通过PAGE 电泳检测其完整性。

‹ 引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。

‹ 模板量不足。

对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

‹ 模板降解。

避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Que：CT 值出现过晚‹ 扩增效率低，反应条件不够优化。

设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

‹ PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。

‹ PCR 产物太长。

一般采用80-150bp 的产物长度。

Que：标准曲线的线性关系不佳‹ 加样存在误差，使得标准品不呈梯度。

‹ 标准品出现降解。

应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

‹ 引物或探针不佳。

重新设计更好的引物和探针‹ 4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高Que：阴性对照也出现明显的起飞‹ 反应mix 或水被污染。

qPCR操作及问题分析来源：刘建玉的日志一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。

由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1u l或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。

当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。

在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。

最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是A BI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。

如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。

由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。

SYBR@Gre en等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR 产物的特异性扩增。

荧光定量PCR常见问题解析荧光定量PCR是目前分子生物学研究中最常使用的技术手段之一，但很多初学者在做荧光定量PCR实验时都会遇到一些问题，为了更好地指导研究生的实验教学，结合我们实验室的经验，特将常见问题总结如下：一、什么样的试剂盒性能较好？性能较好的试剂盒熔解曲线出现单一峰，扩增特异性高，扩增“S”型曲线典型，CT 值较早出现。

目前Roche、ABI、Biog等的试剂盒性能都不错，反应特异性高，有效避免非特异扩增，提高实验效率。

二、熔解曲线出现多峰是什么原因？怎么解决？较为理想的熔解曲线是单峰曲线，如出现多峰有以下原因：1）非特异性扩增：主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高，可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度PCR 对引物退火温度（Tm值）进行优化，上调Tm值，选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂，提高核酸提取质量，等等。

2）引物二聚体可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。

引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100 bp以下。

引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请按照以下方面进行优化：A.优化扩增条件，如提高退火温度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。

通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为60℃。

B.引物浓度太高，适当降低引物浓度。

通常引物的Tm低于目的基因，熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。

大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为200 nM，但如有需要，可将浓度降至60nM。

C.cDNA模板带有基因组DNA污染：重新制备cDNA模板。

在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理，然后逆转录为cDNA。

如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况，就要考虑及时更换试剂盒，避免耽误实验进度。

三、扩增曲线形状异常，如“S”型曲线反应体系引起的扩增曲线不光滑---扩增效率偏差（过高或过低）A. 扩增效率过高出现非特异扩增或引物二聚体：反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差，可能导致出现抑制PCR 反应的现象。

荧光定量pcr扩增曲线异常的原因一、前言荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、快速、准确的分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、药物筛选等领域。

在qPCR实验中，扩增曲线是评价实验质量和数据可靠性的重要指标之一。

然而，在实验过程中，有时会出现扩增曲线异常的情况，影响实验结果的准确性和稳定性。

本文将从样品、引物和试剂等多个方面探讨荧光定量PCR扩增曲线异常的原因，以期帮助读者更好地解决实验中遇到的问题。

二、样品相关原因1. 样品质量差：样品质量差可能导致扩增效率低下或者抑制扩增反应。

例如，样品含有抑制剂（如血红素），或者含有大量的DNA酶或核酸酶等会降低扩增效率。

2. 样品浓度太高或太低：过高或过低的样品浓度可能导致扩增曲线异常。

当样品浓度过高时，可能会发生内部吸收效应，使得荧光信号饱和，导致扩增曲线饱和或者偏离标准曲线。

当样品浓度过低时，可能会导致荧光信号过弱，使得扩增曲线平缓或者不明显。

3. 样品来源不同：不同来源的样品可能存在差异性，如组织、血清、唾液等。

这些差异可能影响反应的特异性和灵敏度，导致扩增曲线异常。

三、引物相关原因1. 引物设计不合理：引物序列设计不合理可能导致扩增效率低下或者特异性差。

例如，引物长度太长或太短、引物序列含有重复序列或GC 含量过高等都会影响PCR反应的特异性和效率。

2. 引物浓度过高或过低：引物浓度过高可能会导致非特异性放大和二聚体形成等问题，而引物浓度过低则会降低PCR反应的效率。

3. 引物质量差：引物质量差可能会导致PCR反应效率低下或者特异性差。

例如，引物受到污染、降解等都会影响PCR反应的稳定性和可靠性。

四、试剂相关原因1. Taq酶质量差：Taq酶是PCR反应中最重要的试剂之一，其质量直接影响PCR反应的效率和特异性。

如果Taq酶质量不好，可能会导致PCR反应效率低下或者特异性差。

2. dNTPs浓度不合适：dNTPs是PCR反应中必不可少的试剂之一，其浓度对PCR扩增曲线的形态有重要影响。

qPCR操作及问题分析来源：一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。

由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。

当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。

在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。

最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。

如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。

由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。

SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。

而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

分析与检测Tlogy科技34 食品安全导刊 2017年4月昆山吉和力仪器有限公司（以下简称“吉和力”）是一家提供专业服务和仪器设备的集成供应商，公司以用户实际需求为导向，提供最合适、性价比最高的仪器，致力于打造一站式服务平台。

为了让业内人士对qPCR 进行更加深入的了解，吉和力整理了一些相关常见问题，并对这些问题一一进行了解答。

qPCR 的英文全称是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。

简单来说，qPCR 就是利用荧光信号的变化，实时监测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

而常规的PCR 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。

如何提高RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？①确定模板RNA 完整性，无DNA 污染；②RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂；③为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase 抑制剂RNasin；④使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱；⑤若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果；⑥设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

避免RNA 降解的方法有哪些？①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；②运用良好无污染技术分离RNA；③将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA 反转录为cDNA 进行低温保存。

RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA 与样品混合，同对照RNA 反应比较产量以检测RNA 抑制剂；若对照RNA 与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA 沉淀进行清洗，以除去抑制剂。

QPCR常见问题及其分析常见问题1. 无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。

模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2. Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低: 反应条件不够优化。

设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

3. 标准曲线线性关系不佳加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。

模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

5. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒。

模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

6. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。

第三部分Real-time qPCR 常见问题分析1. 做标准曲线时候，可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因？建议最好用同样稀释倍数做曲线，因为模板浓度会影响扩增效率。

2. 熔解曲线中，Tm不出现在80度左右？扩增片段100bp左右的，一般应该出现在80度左右。

如果低于此温度出现，可能是模板降解。

3. 扩增曲线没有Ct值，仅仅一条斜线？什么原因？模板浓度过低或者模板降解。

4. ROX 校正为何可以导致熔解峰的不专一？ROX也是一种荧光染料，会有荧光的发生。

5. 如果内参和目标基因表达量差别比较大，也就是目的基因的表达量少，Ctcon=15，Cttarget=38，可否应用？可以用于数据分析。

因为表达量低，从而用过高模板进行扩增，从而同内标的模板不同，反而会增大数据统计的误差。

6. 引物浓度可否是50nM，是否太低？如果扩增曲线和熔解曲线比较好，这个浓度当然可以。

如果更低，扩增结果好的情况下，同样可以运用。

一句话，所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的，会影响扩增效率。

7. miRNA多个扩增时候，如果一个的扩增效果比较，其它熔解曲线不止一个峰，如何解决？Primer对于miRNA是专一的。

所以重新设计引物是不可取的。

那么只能是提高Tm或者更换mastermix 等。

反应体系会影响反应产物的。

8. miRNA反转录引物和定量方法？与mRNA发转录及real-time PCR有和区别？一般常用的反转录primer有2种，一种是step-loop的primer；一种是首先3末端加A，然后ployT再发转录。

用于real-time qPCR的上游primer都是针对miRNA结构本身的；下游有个通用primer。

定量可以用SYBR Green I，也可以用Taqman。

9. 相对定量方法，如果用Ct值比较，是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好？相对定量的方法各有优缺点，主要取决于实验的目的和材料的准备。